棉铃虫磷酸甘油醛异构酶基因Hatpi 的克隆及分析

棉铃虫Helicoverpa armigera是一种严重危害棉花等经济作物的鳞翅目害虫, 开展分子水平研究对防控害虫将具有重要参考意义。本研究利用RACE（rapid amplification of cDNA ends）技术克隆了棉铃虫磷酸甘油醛异构酶(triosephosphate isomerase)基因Hatpi （GenBank登录号为AY736358）。该基因cDNA全长为1 149 bp, 编码248个氨基酸, 预测等电点为5.82, 分子量为16.4 kD。HaTPI含有磷酸甘油醛异构酶类蛋白的典型(βα)8结构、保守的活性位点（Lys12, His94和Glu165）和小肽序列（AYEPVWAIGTG和GGASLKPEF）等。RT-PCR检测分析发现Hatpi在棉铃虫卵巢、幼虫、蛹、成虫均有表达, 提示该基因可能在棉铃虫的不同发育阶段均起作用。     

家蚕MLP基因的克隆及其结构分析

利用生物信息学的方法快速获得家蚕MLP (Muscle LIM protein, MLP)基因cDNA电子序列, 经RT-PCR生物验证正确, 登录GenBank (No. DQ311195)。MLP基因cDNA长2 327 bp, ORF全长1 485 bp, 编码产生494个氨基酸。该MLP基因组DNA含有11个外显子, 10个内含子, 所有内含子/外显子边界都符合典型的GT/AG剪切模式。MLP基因编码的蛋白富含Gly (14.4%), 分子量约为53.03 kDa, 等电点(PI)为8.29。通过BLAST分析发现该基因编码的家蚕肌肉LIM蛋白, 含有5个保守的LIM结构域, 家蚕的另一种LIM蛋白(AAR23823)含一个LIM结构域, 两者可能是通过可变剪切产生; 后者可能通过竞争作用调节前者在肌细胞中的功能。MLP的克隆为进一步研究其体内功能奠定了基础。     

松毛虫DpKettin基因片段的克隆与初步定位研究

对于ZW型鳞翅目昆虫, 雄性为ZZ, 雌性为ZW; 细胞内Z染色体数与常染色体组数之比在雌雄间存在差异, 雄性为2Z∶2A=1.0, 雌性为Z∶2A=0.5, 如果某物种一个基因(假如K基因)位于Z染色体上, 另一个基因(假如N基因)位于常染色体上, 则雄体中2K∶2N=1.0, 雌体中K∶2N=0.5。研究利用家蚕、棉铃虫等昆虫Kettin基因序列, 克隆了松毛虫的同源基因(DpKettin)片段, 并采用荧光定量PCR技术, 以松毛虫的ANT基因为参照基因, 检测松毛虫雌雄不同个体间DpKettin基因与腺苷酸转移酶基因(ANT)的拷贝数之比, 结果表明: 雄体DpKettin∶ANT=1.0, 雌体DpKettin∶ANT=0.5, 说明DpKettin基因位于松毛虫Z染色体上。     

棉铃虫性染色体两种分子标记的克隆及序列分析

为了建立棉铃虫Helicoverpa armigera性染色体的特异性分子标记,利用RAPD-PCR技术对雌雄棉铃虫基因组DNA进行筛选,从500种随机引物中筛选到1 条引物（Operon编号为AF-18）,可扩增出1条约450 bp 的雌性特异片段。经克隆测序并合成特异引物进行验证,表明该片段为棉铃虫雌性特异分子标记,位于W染色体上。利用家蚕、果蝇等昆虫Kettin基因序列,克隆了棉铃虫的同源基因HaKettin片段,并采用荧光定量PCR技术,以棉铃虫的DH-PBAN基因为参照基因,检测棉铃虫雌雄不同个体间HaKettin基因与DH-PBAN基因的拷贝数之比,结果表明：雄体HaKettin∶DH-PBAN=1.0,雌体HaKettin∶DH-PBAN=0.5,据此推断HaKettin基因位于棉铃虫Z染色体上。     

家蚕Bm Tpi基因Z染色体定位

采用实时定量PCR技术,以家蚕Bombyx mori第11号染色体上的DH-PBAN基因为参照基因,检测家蚕不同个体间Bm Tpi基因与常染色体上DH-PBAN基因的拷贝数之比,雄体Bm Tpi∶DH-PBAN=1.0,雌体Bm Tpi∶DH-PBAN=0.5;并用已经定位于Z染色体上的Bm Kettin基因为参照,检测Bm Tpi基因的拷贝数与Bm Kettin基因的拷贝数之比,雄体Bm Tpi∶Bm Kettin=1.0,雌体Bm Tpi∶Bm Kettin=1.0,证明Bm Tpi基因在家蚕基因组中的拷贝数与Bm Kettin基因相同,说明Bm Tpi基因位于Z染色体上。     

棉铃虫腺苷酸转移酶基因的克隆与分析

腺苷酸转移酶(ANT)是线粒体内膜上负责能量分子传导的转运蛋白, 在细胞凋亡调控网络中有重要作用。本研究以棉铃虫幼虫组织的mRNA为模板, 根据鳞翅目昆虫ant基因编码区保守序列设计引物, 进行RT-PCR分析, 同时结合5′、3′ RACE方法扩增出棉铃虫ant基因的全长cDNA序列, cDNA全长为1 190 bp (GenBank登录号AY253868), 具有完整的开放阅读框架(ORF, 133~1 033 bp), 编码蛋白为300个氨基酸, 其中N端22个氨基酸为信号肽, 引导ANT蛋白定位于线粒体内膜。该蛋白具有3个保守的线粒体穿膜功能结构域, 形成能量分子传导的转运通道, 催化细胞质中ADP和线粒体内ATP间进行跨膜交换。通过与其他昆虫的腺苷酸转移酶蛋白序列比较, 发现该基因具有高度的保守性, 氨基酸序列同源性都在90%左右。     

根癌农杆菌介导的灰葡萄孢菌遗传转化研究

以pCAMBIA1300-N载体为骨架, 成功构建了以绿色荧光蛋白(gfp)为报告基因, 潮霉素(hph)为抗性筛选标记的载体pKPG, 并利用根癌农杆菌介导转化系统, 成功获得了能表达绿色荧光蛋白的重组灰葡萄孢菌。通过PCR检测转化子的绿色荧光蛋白基因和潮霉素抗性表达框, 观察菌丝和分生孢子的荧光表型, 以及gfp基因的Southern杂交验证, 结果表明：被测转化子基因组中均成功整合了目的基因片段。