乙肝治疗耐药基因突变的焦磷酸测序技术诊断

目的：建立焦磷酸测序技术检测拉米夫定和阿德福韦酯治疗乙肝所致乙肝病毒基因耐药突变的定量检测方法,为临床乙肝耐药诊断和治疗提供依据。方法：针对乙肝病毒DNA聚合酶基因序列上4个常见基因突变位点的6种突变形式,分别克隆构建野生型和突变型质粒作为标准品,应用生物信息学手段设计目标基因通用PCR引物和各突变点的焦磷酸测序引物,建立焦磷酸测序的突变检测方法。对接受拉米夫定、阿德福韦酯治疗的慢性乙型肝炎患者血清标本进行检测。结果：构建了乙肝病毒四种常见耐药性突变的标准株和变异株克隆,建立了分别或同时检测拉米夫定、阿德福韦酯耐药突变的焦磷酸测序方法,对68例临床耐药或疑似耐药的患者血清标本进行检测,双脱氧测序验证,检出拉米夫定耐药突变32例,阿德福韦酯耐药突变5例,其中焦磷酸测序检出20例为混合突变,而双脱氧测序显示为6例。结论：成功建立了焦磷酸测序定量检测拉米夫定、阿德福韦酯耐药基因突变的方法,构建了乙肝病毒耐药基因突变的标准质粒,为临床动态监测乙肝病毒变异病毒株、指导合理用药奠定了基础。     

肝细胞癌患者血清外泌体microRNA表达鉴定

目的:探讨肝癌细胞外泌体中差异表达的microRNAs(miRNAs)在肝细胞癌(HCC)诊断中的应用价值。方法:通过高通量测序筛选肝癌细胞外泌体中差异表达的miRNAs。实时定量PCR验证差异表达分子;检测差异表达的miRNAs在健康人(Health)、慢性乙型肝炎患者(CHB)、肝硬化患者(LC)及乙型肝炎病毒阳性的肝细胞癌患者(HCC)血清外泌体中的表达。结果:高通量测序筛选到肝癌细胞外泌体中差异表达的miRNA共88种,其中58种表达上调,30种表达下调。选择其中8种差异表达的miRNAs进行q RT-PCR验证,结果显示,此8种miRNAs在细胞上清外泌体、细胞内、癌与癌旁组织中的表达趋势与测序结果一致。miR-221-3p和miR-224-5p在HCC组外泌体中的表达水平显著高于Health组、CHB组和LC组(P0.01),miR-124-3p和let-7a-5p在HCC组外泌体中的表达水平显著低于其他各组(P0.05)。四个组中,miR-21-5p、miR-191-5p、miR-34a-5p和miR-122-5p的表达水平不存在显著性差异(P0.05)。结论:血清外泌体中的miR-221-3p、miR-224-5p、miR-124-3p和let-7a-5p可能成为肝细胞癌的候选标志物。     

高通量流式荧光微球悬液芯片检测乙肝病毒基因分型

目的:建立HBV基因分型高通量液相芯片检测技术,并探讨其应用价值.方法:对GenBank中收录的明确分型的HBV基因序列进行分析,选择preS2-S区设计引物和A、B、C和D型特异性探针.与荧光编码微球偶联的特异型探针与一条引物生物素标记的PCR产物直接杂交反应,然后结合亲和素标记的藻红蛋白,用流式检测仪(Bio-Plex 200)检测荧光信号.检测182份阳性乙肝患者血清DNA,其中35份样品检测结果与测序法比较.用B、C型质粒DNA倍比稀释及混合样品检测灵敏度来评估该方法.结果:建立了HBV基因分型的快速高通量液相芯片检测方法.182份患者血清检测结果为:B型占24.2％ (44/182),C型占71.4％(130/182),D型为6.6 ％(12/182),BC混合型4.4％(8/182).其中35份样本与测序法比较,除3份混合型测序法未检出外,其它32例结果均相同本方法的灵敏度检测下线为1×103 copies/mL.结论:应用悬液芯片技术进行乙肝病毒的基因分型分析,具有较好的特异性和较高的灵敏度,并有简便、灵活和高通量等优势.该检测系统不仅在科研中有广泛的前景,也有望成为临床推广的多重分子诊断和基因分型的新方法.     

PLCE1基因及rs2274223和rs3765524单体型的克隆与表达

目的：克隆人PLCE1基因,构建PLCE1 rs2274223和rs3765524 GT（PLCE1 Minor）和AC（PLCE1 Major）单体型真核表达重组载体,研究PLCE1基因多态性及单体型与基因表达的相关性。方法：利用重叠延伸PCR、In-Fusion技术构建PLCE1真核表达载体;基于同源重组的双点突变技术改造目的基因;利用基因转染、实时定量PCR和蛋白印迹等技术实现PLCE1表达载体在真核细胞中的过表达及表达水平的鉴定。结果：成功扩增并获得了全长6 927bp的人PLCE1 cDNA并经过DNA测序证实,与NCBI数据库PLCE1参考序列（NM_016341）比较,发现编码区3 554~3 572bp处存在18bp连续碱基插入,其余序列基本匹配。成功构建了PLCE1 Minor和PLCE1 Major两种单体型重组真核表达载体,转染细胞揭示PLCE1 Minor型的mRNA转录和蛋白质表达水平均高于Major型。结论：发现了一种新的PLCE1 mRNA转录本,成功构建了2种单体型真核表达载体;发现PLCE1 rs2274223G-rs3765524T单体型能够促进自身mRNA和蛋白质表达,为进一步揭示PLCE1 SNPs与癌症易感性的关系奠定了基础。     

一种简易SNP检测方法的建立

目的：建立一种快速、简单的SNP（Single Nucleotide Polymorphisms）检测方法。方法：设计带生物素标记的扩增引物对检测用具有单碱基差异的野生型和突变型靶序列分别进行扩增,然后通过紫外交联的方式将相应检测靶序列的探针固定在硝酸纤维素膜上,借助Taq酶完成膜上单引物延伸,从而对探针捕获的靶序列进行延伸固定在膜上,最后使用生物素．亲和素酶联显色（ABs-ELISA）反应肉眼观察结果。结果：阳性和阴性对照探针显示正常。野生型探针和突变型探针能够分别特异性结合靶序列,并通过生物素和亲和索显色系统放大为一种肉眼可判断结果的检测形式。结论：建立了一种基于硝酸纤维素膜载体上进行核酸扩增的SNP检测方法。     

不同亚型脂联素与非酒精性脂肪性肝病的关系

目的:探究总脂联素(total adiponectin,total APN)和高分子量脂联素(high-molecular-weight adiponectin,HMW APN)与非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic Fatty Liver Disease,NAFLD)的关系。方法:连续纳入50名男性健康男性及50名非酒精性脂肪性肝病男性患者,收集患者临床资料及其他临床生化数据,通过ELISA法检测总脂联素、支链氨基酸及可溶性晚期糖基化终末产物含量,Western blot法测定高分子量、中分子量和低分子量脂联素水平,进一步分析其相关性。结果:与对照组的健康受试者相比,NAFLD患者的总脂联素和三种不同形式的脂联素水平均显著降低。在NAFLD患者中,总脂联素与身高(R=-0.270, P=0.032)和羧甲基赖氨酸(R=-0.259, P=0.040)显著负相关;高分子量脂联素与空腹血糖(R=0.350, P=0.016)显著正相关,与丙氨酸氨基转移酶(R=-0.321, P=0.029)和天门冬氨酸氨基转移酶(R=-0.295, P=0.045)显著负相关。结论:总脂联素和三种不同形式的脂联素水平均与NAFLD呈显著负相关。     

mitoTEMPO改善糖尿病小鼠脂肪干细胞的氧化损伤

目的:探讨线粒体靶向抗氧化剂mitoTEMPO对糖尿病小鼠脂肪干细胞(Adipose-derived stem cells,ADSCs)氧化损伤的影响。方法:采用60%高脂饮食喂养雄性C57小鼠(4周龄)连续8周,并在高脂喂养第2周,对小鼠进行连续5天腹腔注射低剂量链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)(25 mg·kg-1)制备2型糖尿病小鼠模型。喂养2周后,检测小鼠血浆葡萄糖水平等指标符合2型糖尿病标准者纳入实验。分别从正常小鼠与STZ诱导的糖尿病小鼠的腹股沟处皮下脂肪组织分离培养脂肪干细胞(ADSCs),并将其各分为4组:DMEM培养的正常ADSCs组(nADSCs组),DMEM培养的糖尿病ADSCs组(dADSCs组),TEMPO治疗的糖尿病ADSCs组(T-dADSCs组),mitoTEMPO治疗的糖尿病ADSCs组(mitoT-dADSCs组)。采用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)检测细胞存活能力;油红-O和茜素红染色分别检测成脂细胞分化与成骨细胞分化能力;划痕实验和Transwell试验分别测定细胞迁移能力;DCF和mito SOX染色荧光成像分别检测细胞内和线粒体中的活性氧簇(Reactive oxygen species, ROS)水平。结果:①与nADSCs组相比,d ADSCs组的细胞活力明显下降(P0.05)、成骨细胞分化与成脂细胞分化程度明显下降(P0.05)、脂肪干细胞迁移能力明显下降(P0.05)、细胞内和线粒体中ROS水平明显升高(P0.05)。②与dADSCs组相比,T-dADSCs和mitoT-dADSCs组的细胞内和线粒体中的ROS水平明显降低(P0.05);与dADSCs组相比,mitoT-dADSCs组的成骨细胞分化与成脂细胞分化能力明显提升(P0.05),基本达到nADSCs组的分化水平;与dADSCs组相比,mitoT-dADSCs治疗组的细胞迁移能力显著升高(P0.05)、T-dADSCs组的细胞迁移能力增长无明显差异。结论:mitoTEMPO可以减轻糖尿病时线粒体内活性氧簇蓄积造成的脂肪干细胞的氧化应激损伤与功能紊乱。