单增李斯特菌末端氧化酶亚基QoxB的生物学功能探究

【目的】本研究旨在构建单增李斯特菌末端细胞色素aa3氧化酶亚基qoxB基因缺失株,并探索其在细菌生长及感染过程中发挥的生物学功能。【方法】利用同源重组方法构建获得缺失株ΔqoxB后,对野生株EGD-e和缺失株ΔqoxB的生长能力、细菌运动能力和细胞内黏附、侵袭、增殖及胞内迁移能力进行比较,同时利用荧光定量PCR方法检测ΔqoxB中鞭毛相关基因转录水平的变化。【结果】缺失qoxB基因后细菌在体外培养过程中生长能力没有差异,细菌的鞭毛运动能力显著降低,在30℃培养24 h和48 h后ΔqoxB运动圈直径分别较EGD-e下降35.86%和34.20%,且22个鞭毛相关基因转录水平显著降低。通过细胞感染试验发现缺失qoxB基因后细胞黏附、侵袭、增殖及胞内迁移能力均显著下降。【结论】本研究首次证实末端氧化酶亚基QoxB能降低单增李斯特菌的运动能力和对细胞的感染能力,此研究为进一步阐明末端细胞色素氧化酶影响单增李斯特菌的致病机制提供重要依据。     

携带新城疫病毒融合蛋白基因的重组减毒单核细胞增多性李斯特菌构建与鉴定

以鸡新城疫病毒F基因(NDV-F)为模式外源基因,通过基因切割-重叠延伸PCR法(SOE-PCR)将其插入到单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)毒力基因hly的启动子和信号肽序列下游,并将该融合片段克隆入穿梭质粒pKSV7,随后将重组质粒电转李斯特菌进行同源重组。NDV-F基因的PCR扩增表明该重组菌构建成功,RT-PCR结果表明F基因在重组菌中得到了转录。比较了重组菌和野生型菌株的溶血性、黏附和侵袭力、对小鼠和鸡胚的毒力和生长特性以及重组菌的体内外稳定性,结果表明:hly基因中F片段的整合消除了单核细胞增多性李斯特菌溶血素基因的表达,其培养上清液没有溶血性,而野生型菌株的溶血价达24;细胞试验表明重组菌对细胞的黏附力和相对侵袭力均有不同程度的降低,而相对侵袭力与野生型菌株具有显著性差异(P<0.05);重组菌对小鼠及鸡胚的毒力(LD50)与野生型相比分别下降3.7和6.5个对数数量级;重组菌在BHI肉汤和小鼠体内连续5次后,仍然可以扩增出目的基因NDV-F,初步表明该重组菌较为稳定。     

单核细胞增多性李斯特菌在体外模拟消化道环境中的抗性

[目的]通过测定存活率及细胞内pH(pHi)变化,分析单核细胞增多性李斯特菌(单增李斯特菌)在体外模拟消化道中的抗性.[方法]模拟唾液、胃液和小肠液根据其主要组成成分配制,按试验设计顺次加入后获得模拟的消化道各段混合液(包括相应的pH及其可能的范围).平板计数法测定单增李斯特菌在模拟消化液中的存活率,并用荧光比例成像显微镜(fluorescence ratio imaging microscopy,FRIM)测定细菌的pHi.[结果]单增李斯特菌在唾液中存活率＞90％;经pH≤3.0的胃液处理后,其在胃液和胃-肠混合液中的存活率低于0.05％;提高胃液pH至3.5,细菌存活率开始上升;在胃液pH4.0时,两株单增李斯特菌在模拟胃肠液中存活率显著提高(11.2％-85.9％).FRIM研究表明,单增李斯特菌在模拟唾液中的pHi与对照组相近.经过pH为3.5和4.0的胃液和胃-肠混合液处理后,pHi值仍维持在较高水平(＞7.75).[结论]单增李斯特菌在经过pH≥3.5胃液后,能够维持菌体细胞内的pH稳态,且存活率较高,表明其细胞膜仍保持完整.     

单核细胞增多性李斯特菌OpuCA蛋白介导抗氧化应激和宿主感染研究

【目的】本文旨在研究opuCA基因在单核细胞增多性李斯特菌(单增李斯特菌)生长过程及渗透胁迫下发挥的作用,探究opuCA基因参与细菌抗氧化应激和致病力的生物学功能,为阐明OpuCA蛋白介导细菌环境适应和宿主内感染的机制奠定基础。【方法】利用细菌同源重组方法获得opuCA缺失株及回补株后,通过分子生物学、感染生物学和激光共聚焦技术,研究野生株和突变株的生长能力、抗渗透应激能力、抗氧化应激能力、细胞粘附、侵袭以及胞内增殖能力。【结果】缺失opuCA基因后,李斯特菌体外生长能力并没有受到影响,但在渗透条件下生长能力减弱;opuCA缺失株在铜离子和镉离子中抗氧化应激能力降低,但在巯基特异性氧化剂肼应激中无明显变化;opuCA缺失株在细胞中的侵袭能力显著减弱,且缺失该基因导致细菌聚合actin能力下降,进而影响了细菌在胞间迁移。【结论】本研究首次证实了缺失opuCA基因能降低单增李斯特菌抗氧化应激能力和感染宿主能力,并且在渗透胁迫下细菌生长能力减弱,但具体的分子机制有待深入研究。本研究有助于深入理解单增李斯特菌OpuCA蛋白介导的细菌体外环境适应及宿主内感染的分子机制,为防控单增李斯特菌感染提供...     

李斯特菌毒力因子及其进化

李斯特菌属包含6个种,毒力各有差异。在细菌耐受外界环境、黏附侵袭及细胞内感染过程中,毒力因子各司其职又相互协作。毒力基因常聚集为毒力岛,其中PrfA依赖型毒力基因簇(LIPI-1)与内化素岛(LIPI-2)是致病种最重要的两个毒力岛。李斯特菌各个种可能来源于同一个携带有完整毒力岛的祖先,在长期进化过程中,通过基因水平转移或重组、整合等事件,演化为目前流行的6个种。噬菌体、转座子、质粒等可能扮演着毒力进化执行者的角色。一些天然非典型菌株是目前研究的热点,如含有LIPI-1的无害李斯特菌和缺失LIPI-1的塞氏李斯特菌,其演化进程可能尚未达到或已超越目前流行的状态,为李斯特菌毒力进化的研究提供了重要线索。     

鸡新城疫口服DNA疫苗的安全性、稳定性与免疫效力

将含新城疫病毒（NDV）F₄₈E₉株融合蛋白（F）基因的真核表达质粒pcDNA3-F的减毒鼠伤寒沙门氏菌ZJ111株（ZJ111/pcDAN3-F）口服接种小鼠和雏鸡。结果表明：利用该减毒株作为载体传递DNA疫苗具有相对安全性。用酶切和PCR鉴定法证实在体内外无抗生素存在的条件下重组质粒在受体菌ZJ111菌株内比较稳定。ZJ111/pcDAN3-F以每羽10⁸cfu免疫雏鸡,2周后二免,二免后4周攻击致死剂量的强毒株F₄₈E₉,观察其免疫效力。结果表明：重组ZJ111/pcDNA3-F菌株不仅能诱导雏鸡产生抗NDV抗体,而且能诱导法氏囊B淋巴细胞和胸腺T淋巴细胞的增殖反应,对强毒株攻击的保护率为66.7%,高于pcDNA3-F裸质粒DNA疫苗注射免疫组（50%）。上述结果初步提示减毒沙门氏菌为载体传递DNA疫苗具有良好的安全性、稳定性和免疫原性,为研制低成本、实用化的口服禽类DNA疫苗奠定了基础。     

杆状病毒-昆虫细胞表达系统在复合体重组表达应用中的研究进展

真核细胞大部分生命活动是通过复合体催化的。因此,系统了解这些复合体的生物学功能,将在健康和疾病方面具有重要意义。由于内源性复合体存在低丰度和异质性特点,因而直接提取复合体存在一定的困难。杆状病毒-昆虫细胞表达系统可成功表达复合体,为研究复合体的结构和功能提供新的手段。综述近年来利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统进行蛋白质复合体结构和功能研究的进展。     

单增李斯特菌二硫键形成蛋白DsbG介导酸耐受及鞭毛运动性调控北大核心

【目的】本研究旨在通过构建单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)二硫键形成蛋白编码基因dsbG缺失株和回补株,探究该蛋白在酸耐受和鞭毛介导的运动性中发挥的生物学功能。【方法】利用同源重组方法构建单增李斯特菌dsbG缺失株和回补株,比较野生株和突变株在不同pH梯度培养基条件下的生长速率和存活率;通过实时荧光定量PCR方法,比较致死酸应激条件下野生株和缺失株酸耐受基因转录水平。通过半固体培养基、荧光定量PCR方法和鞭毛负染色透射电镜观察,比较野生株和突变株的运动能力、鞭毛相关基因转录水平变化和鞭毛形态差异。【结果】与野生株相比,dsbG缺失株的生长能力和速率差异不显著;在pH 3.5(盐酸和柠檬酸)培养条件下,存活率显著降低;精氨酸合成途径基因argD和argF转录水平分别下调2.4和3.7倍。同时,dsbG缺失株的运动能力减弱,且鞭毛形成相关的flaA、flgB和flgD等基因转录水平显著下调(分别为29.7、6.7和6.9倍),鞭毛形成能力减弱。【结论】本研究首次证实了单增李斯特菌二硫键形成蛋白DsbG能感应低pH应激,并形成耐受;证实了DsbG通过调控鞭毛相关基因的转录进而影响细菌的鞭毛形成和运动性。本研究有助于深入了解二硫键形成蛋白家族介导单增李斯特菌环境适应的分子机制,为食源性致病菌的防控提供理论基础。