大鼠甘氨肽酰化单氧酶在CHO细胞中的活怀表达及在体外酰胺化？…

将大鼠脑ＣＤＮＡ库来源的ＰＡＭ基因片段,经克隆重组,成真核表达质粒ＰＳＶ－ＰＡＭ〈并转染ＣＨＯ细胞,获得在ＣＨＯ中稳定表达活性型α－酰胺化酶的细胞株ＤＧＡＥ。 物为双功能酶,分泌至培养基中的酶活力远高于胞内。体外酰胺化加工研究表明。以α－Ｎ＿ａｃｅｔｙｌ－Ｔｙｒ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ为底物,该酶催化反应的Ｋｍ为１２．５μｍｏｌ／Ｌ,Ｖｍａｘ为１８０μｍｏｌ／ｍｇ／ｈ,而且催化反应中表现中有最适铜离子浓度     

肽的α-酰胺化研究进展

α-酰胺化是神经和内分泌系统中许多生物活性肽重要的翻译后加工过程,由酰胺化酶PAM催化完成.PAM是一个双功能酶,含有两个催化结构域：PHM和PAL,顺序催化酰胺化两步反应.PAM的ｍRNA和蛋白质具有多样性.作为活性肽生物合成途径中的限速酶,PAM的表达及活力水平具组织特异性,受激素及发育中的相关因素的调节.     

大鼠甘氨肽酰化单氧酶基因的克隆与表达

本文采用原位杂交及ＰＣＲ方法,从大鼠脑ｃＤＮＡ库中,筛选到３个大鼠甘氨肽酰化单氧酶（ｒＰＡＭ）基因片段。经ＤＮＡ全序列分析表明,它们跨越ｒＰＡＭ－２全部编码区。通过点突变、ＰＣＲ重组技术等,分别拼接出此双功能酶的ｒＰＨＭ（氧化酶）、ｒＰＡＬ（裂解酶）及其ｒＰＡＭ全酶基因,并构建了多种大肠杆菌表达质粒。经温敏诱导。高效表达了ｒＰＡＭ－Ｎ２６０片段,并制各获得阳性抗血清,可用于免疫检测天然或重组的ＰＡＭ。而ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析结果显示,ｒＰＨＭ和ｒＰＡＭ在大肠杆菌中均获得了表达,其中ｒＰＨＭ表达量占全菌总蛋白的１０％以上。进一步研究还发现,通过采用低温和加二价铜离子诱导表达,可提高ｒＰＨＭ产物的可溶性及稳定性。     

用毛细管电泳法进行C端酰胺化结构分析和酰胺化酶活？…

利用酰胺化基团与羧基在一定的缓冲液中表现出不同的电性和疏水性,建立了以毛细管电泳为基础的多钛Ｃ端酰胺化结构分析和酰胺化酶活性测定的新方法。     

用毛细管电泳法进行C端酰胺化结构分析和酰胺化酶活性测定

利用酰胺化基团与羧基在一定的缓冲液中表现出不同的带电性和疏水性,建立了以毛细管电泳为基础的多肽Ｃ端酰胺化结构分析和酰胺化酶活性测定的新方法。     

肽的α—酰胺化研究进展

α－酰胺化是神经和内分泌系统中许多生物活性肽重要的翻译后加工过程,由酰胺化酶ＰＡＭ催化完成。ＰＡＭ是一个以功能酶,含有两个催化结构域：ＰＨＭ和ＰＡＬ,顺序催化酰胺化两步反应,ＰＡＭ的ｍＲＮＡ和蛋白南具有多样性,作为活性肽生物合成途径中的限速酶,ＰＡＭ的表达及活力水平具组织特异性,受激素及发育中的相关因素的调节。     

大鼠甘氨肽α—羟化单氧酶在昆虫细胞中的活性表达

将编码大鼠甘氨肽α－羟化单氧酶（ＰＨＭ）ｃＤＮＡ基因,插入昆虫杆状病毒转移表达载体ｐＢａｃＰＡＫ８,构建成表达质粒ｐＢａｃＰＨＭ２,与修饰的银纹夜蛾核多角体病毒ＢａｃＰＡＫ６线性化ＤＮＡ共转染秋粘虫细胞Ｓｆ２１,通过同源重组,得到在核多角体蛋白基因启动子控制下的ＰＨＭ基因的重组病毒ＢａｃＰＨＭ。用ＢａｃＰＨＭ感染Ｓｆ２１细胞,无血清培养上清在７２小时后检测到酰胺化酶最高活力;用细胞免疫组化法和免疫     

大鼠甘氨肽酰化单氨酶基因的克隆与表达

本文采用原位杂交及ＰＣＲ方法,从大鼠脑ｃＤＮＡ库中,筛选到３个大鼠甘氨肽酰化单氧酶基因片段。经ＤＮＡ全序列分析表明,它们跨越ｒＰＡＭ－２全部编码区。通过点突变,ＰＣＲ重组技术等,分别拼接出此双功能酶的ｒＰＨＭ,ｒＰＳＡＬ及其ｒＰＡＭ全构建了多种大肠杆菌表达质粒。     

大鼠酰胺化酶的信号肽引导的昆虫细胞表达外泌系统

将大鼠酰胺化酶的信号肽及前导肽编码序列引入昆虫核多角体病毒转移表达载体,构建ＰＡＢＣｈＧＲＦ（Ｇｌｙ）、ＰＡＢＣＩＧＦＩ融合基因的昆虫细胞分泌表达质粒ｐＢａｃＰＡＧ２、ｐＢａｃＰＡＩ,并与经修饰的银纹夜蛾核多角体病毒ＢａｃＰＡＫ６线性化ＤＮＡ共转染秋粘虫细胞Ｓｆ２１,通过同源重组、筛选和鉴定,得到它们的重组病毒ＢａｃＰＡＧ、ＢａｃＰＡＩ。将重组病毒感染Ｓｆ２１细胞,ＰＡＢＣｈＧＲＦ（Ｇｌｙ）和ＰＡＢＣＩＧＦＩ均得到有效外泌表达,表达产物通过ＩｇＧＳｅｐｈａｒｏｓｅ柱可获得快速纯化。