四核苷酸重复序列单链扩增特性及机理探究

简单重复序列广泛存在于多种生物基因组中,其生物学意义越来越受到人们的重视.许多简单重复序列易于扩增变长,某些重复序列的异常延伸是造成一些遗传疾病的直接原因.本研究以20 nt的60种四重复和6种二重复序列单链为模板,系统研究了它们在嗜热DNA聚合酶作用下等温扩增的特点.电泳结果显示,多数单链模板能扩增变长,即使链内没有互补碱基的序列也可被扩增,如(AGGA)5.定量分析结果显示:回文序列扩增最快;二重复序列比相同碱基组成的四重复序列有更宽的适于扩增的温度范围;G和C含量多的DNA较G和C含量少的序列更易扩增,而且G和C含量越多越适于在较高的温度下扩增;重复单位含两相同嘧啶的链多数比其互补链更易扩增;产物浓度与时间基本呈线性关系.限制性酶切产物结果显示,扩增产物与模板具有相同的重复单位,是重复序列的简单延伸.最后,根据实验结果和相关文献,提出了包括链内滑动扩增和发卡DNA介导扩增两阶段的重复序列单链扩增模型,以对重复序列非特异扩增和相关疾病发生机制的研究提供参考.     

DNA模板中发卡结构对定量PCR扩增的影响

[目的]探究模板引物结合区发卡对定量PCR的影响及优化方法。[方法]用分布连接法构建一系列在模板引物结合区含环大小为5~60 nt,茎长9 bp的DNA模板,考察发卡环部大小、茎干区GC含量对q PCR扩增效率的影响,再针对引物浓度、引物长度及退火温度来优化含发卡结构DNA模板的扩增。[结果]环区为5~40 nt时,其Ct值比对照组高1.3~4.2,对q PCR的抑制作用与环大小成负相关;茎长9 bp发卡结构当GC含量达3 bp以上时会对定量扩增产生明显抑制作用;增加引物长度、提高引物浓度和退火温度可提高发卡模板的扩增效率。[结论]模板引物结合区环大小在40 nt以内,茎长达9 bp的发卡结构对q PCR扩增会产生抑制作用,通过增加引物长度、提高引物浓度和退火温度可缓解此类抑制。     

转运过程中Caco-2细胞对外源miR-133a摄取规律探究

[目的]探究外源miR-133a在Caco-2细胞转运过程中细胞摄取的规律。[方法]建立Caco-2细胞模型以探究miR-133a在体内吸收情况;以Cy3标记的miR-133a对细胞摄取miR-133a的状态和过程进行探究;以细胞破碎液来评价被摄入的miR-133a在胞内的稳定性;通过细胞在不同温度下摄取miR-133a状态来评价细胞摄取miRNA途径。[结果]通过RT-q PCR检测到24 h内外源miR-133a能够以完整片段地形式被Caco-2细胞所转运,最大转运量占加入的总片段量的5.51×10~(-3)%;Caco-2细胞能够摄取外源miR-133a,24 h后达到饱和状态,吸收率达7.2%;被摄入的miR-133a主要分布于细胞质,且部分会围绕细胞核分布;摄入胞内的外源miR-133a在24 h后残留量占总量的0.04%;miR-133a的细胞摄取过程需要消耗能量。[结论]证明了Caco-2细胞能够主动摄取外源miR-133a,孵育24 h的吸收率为7.2%,且摄取为能量依赖过程。     

三核苷酸双链重复序列扩展合成特性及其机理

简单重复序列在各种生物基因组中广泛存在,同分子进化、遗传多样性、分子标记和某些遗传性疾病等密切相关．本文以全部32种18 bp三核苷酸双链重复序列作为研究对象,对它们在聚合酶作用下的扩展合成进行了系统研究．探讨了反应温度、序列本身等对扩展效率和产物长度的影响．结果显示,几乎所有的序列都能扩展变长．但序列对其扩展效率有很大影响：GC含量较多的短链,尤其是一条链中同时有G和C的短链扩展效率较高;全由AC和GT组成的双链也较易扩展．短链的最适扩展温度与短链GC组成呈一定的正相关关系．琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳分析发现,大部分产物单一性良好,且产物分子质量的大小随反应时间线性增加;随着反应温度升高,产物差异性增大．最后分析了双链重复序列的“复制滑移”扩展机理,有望为进一步研究重复序列的分子进化和基因检测中的非特异性扩增等奠定基础．