小鼠肝炎病毒受体研究进展

小鼠肝炎病毒属于冠状病毒科,不同的MHV毒株可引起易感动物的肠炎、肝炎以及脑脊髓炎。MHV的受体属于免疫球蛋白超家族中癌胚抗原家族成员,称为CEACAM。具有4个免疫球蛋白样结构域、一个跨膜结构域和一个胞浆内尾。受体的多种同型体都可作为MHV的功能性受体。已确定小鼠CEACAM1 a同型体结构域1和4可溶性外结构域的晶体结构。MHV受体的研究为病毒受体类似物作为病毒异体亲嗜性和种间交叉传播的途径提供了依据。     

波摩那型钩端螺旋体外膜蛋白LipL32基因片段的克隆表达

目的　构建L3 2_pGEX_5x_2重组质粒 ,诱导表达重组钩端螺旋体外膜脂蛋白LipL3 2。方法　PCR获取编码LipL3 2的基因片段 ,构建重组克隆载体和表达载体 ,转化受体菌 ,诱导表达重组LipL3 2蛋白。将重组LipL3 2蛋白和钩体抗血清进行Western_blot。结果　扩增出约 750bp的LipL3 2成熟蛋白基因 ,LipL3 2基因插入pGEX_5x_2表达载体 ,表达产物谷胱甘肽S_转移酶 (GST ,2 6× 10 3)与LipL3 2蛋白的融合蛋白的相对分子质量约为 53× 10 3 ,与预期大小一致。Western_blot显示重组LipL3 2蛋白能与钩体抗血清特异结合。结论　LipL3 2蛋白能在大肠埃希菌中表达 ,重组LipL3 2蛋白具有免疫反应性     

我国两株登革2型病毒基因组的全序列分析

本研究对我国两株登革2型病毒D2-43株、D2-04株的基因组进行了全序列测定,在此基础上对这两株引起不同临床症状及鼠神经毒力的登革病毒的基因组序列进行了比较分析,结果表明D2 43株与D2-04株基因组全长约为10 723nt,核苷酸序列的同源性为95.1%,氨基酸序列的同源性为97 6%,不存在特别的高变区.这两株序列中共有83个核苷酸的变化导致了氨基酸的变化,其中21个差异氨基酸可引起所在位点电荷或极性的变化,位于登革病毒粒子表面的E糖蛋白第126位氨基酸由Glu(D2-04株)→Lys(D2-43株)的变化对其抗原性有影响,可能引起了病毒对鼠神经毒力的改变.对结构糖蛋白E基因的聚类分析表明D2-43株与新几内亚株、台湾87株及菲律宾83株亲缘关系较近,D2-04株与牙买加株及巴西90年分离株的亲缘关系较近,表明我国存在不同起源的登革2型病毒感染.     

我国两株登革2型病毒5′和3′端非编码区序列测定及二级结构分析

 为测定我国两株临床症状、乳鼠神经毒力不同的登革 2型病毒流行株 5′和 3′端非编码区序列 (untranslated region,UTR) ,分析二级结构差异与毒力变化的关系 ,分别从 D2 - 0 4、D2 - 44株感染的 C6/ 36细胞及鼠脑中提取总 RNA.以该 RNA为模板 ,利用 RACE法 ,分别扩增了 D2 - 0 4、D2 -44株的 5′和 3′末端 c DNA片段 .将其分别与 p GEM- T载体连接得到重组质粒 ,测定上述 c DNA插入片段的序列 .用 RNAdraw软件预测 D2 - 0 4、D2 - 44株 5′和 3′端非编码区的二级结构 .D2 - 0 4、D2 -44株 5′端和 3′端非编码区分别有 96和 454个核苷酸 .其中 5′非编码区 59位 C(D2 - 0 4 )→T(D2 -44 ) ,使 D2 - 44二级结构稳定性下降 ;3′端非编码区有 1 5个核苷酸不同 ,其中 T(355)→ A,T(32 6)→ G引起了所在位置二级结构自由能变化 ,且分别位于两个保守序列区 (conserved sequence,CS)CS1、CS2 A.这些位点变化可能与毒力有关 .     

重组钩端螺旋体外膜蛋白酶联免疫吸附(ELISA)检测方法的建立

目的建立以重组外膜蛋白为基础的钩端螺旋体抗体间接ELISA检测方法。方法以基因重组技术获取重组钩端螺旋体外膜蛋白LipL32,以该蛋白为抗原,特异的钩体抗血清进行ELISA方阵滴定、交叉性试验、阻断试验,并对北京地区的70份犬血清使用建立的ELISA方法以及德国Virion公司的全菌体钩端螺旋体ELISA试剂盒进行相互验证。结果方阵滴定试验确立以100ng/孔为抗原包被浓度,1∶160为血清稀释度。交叉性试验具有广泛性、阻断试验标明该方法特异性强、灵敏度高。两种方法数据经χ2检验,两者检出率之间差异不显著。结论重组LipL32蛋白具有结合活性。初步建立了以重组LipL32蛋白为抗原的钩端螺旋体抗体间接ELISA检测方法。     

嵌合型HCV全长cDNA的构建及体外转录制备感染性RNA的研究

构建HCV la/1b嵌合型全长cDNA克隆,进行体外转录,脂质体法转染HepG2细胞,以RT-PCR法检测HCV正、负链RNA,Western印迹检测HCV蛋白表达.结果表明,细胞在转染后8代(约35d)内,能间断检测到HCV正、负链RNA以及相对分子质量约70000的HCV NS3蛋白,证明该HCV嵌合体可以在细胞中复制和表达.本研究表明含有该嵌合型全长cDNA的质粒可以为后续HCV的研究提供大量可重复的性质均一的病毒模板,有助于深入了解HCV的复制机制.     

稳定表达HCV 1a NS5A和NS5A-△ISDR细胞株的构建

以pBRTM／HCV-3011模板,通过PCR法扩增ns5α、LISDR(左端序列)和RISDR(右端序列),分别经XhoⅠ／EcoRⅠ、XhoⅠ／HindⅢ和EcoRⅠ／HindⅢ双酶切,连入穿梭质粒pEGFP—N3中,构建重组质粒pEGFP—N3-ns5a和pEGFP—N3-ns5a—△ISDR。对重组质粒进行酶切分析和序列测定。将这2种重组质粒通过电穿孔法转染HeLa细胞,然后在G418选择压力下进行有限稀释法筛选,用RT-PCR和荧光显微镜鉴定。经酶切鉴定和基因测序证实,重组穿梭质粒已插入目的片段ns5a、LISDR和RISDR。RT-PCR和荧光显微镜检测到目的基因的表达。以上结果说明成功构建了真核表达载体pEGFP—N3-ns5a和pEGFP—N3-ns5α—△ISDR,目的基因在HeLa细胞中得到表达,为研究HCV NS5A中是否存在抗干扰素治疗的功能蛋白提供了实验材料。     

丙型肝炎病毒ns3区全长基因在大肠杆菌中的高效表达及纯化

利用PCR技术扩增HCV ns3基因,经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后与原核表达质粒pProEX—HTb连接,转化感受态细胞Ecoli DH50α,酶切鉴定得阳性重组质粒pProEX—HTb—ns3并测序;pProEX—HTb—ns3转化宿主细胞获得工程菌,用IPTG诱导,获得NS3蛋白的高效表达,薄层扫描显示其占菌体总蛋白的35％;目的蛋白在变性条件下经Ni^2 -NTA凝胶亲和层析纯化,透析并浓缩后用丙型肝炎患阳性血清做为一抗行Western—Blot证实特异性和抗原性。结果成功表明,诱导表达产物主要以包涵体形式存在;6His—NTA纯化后获得目的蛋白,Western—blot结果显示纯化蛋白具有良好的抗原性。HCVNS3蛋白的高效表达及纯化,为利用NS3蛋白作为诊断抗原及制备单克隆抗体奠定了基础。     

百令胶囊联合左卡尼汀对维持性血液透析患者氧化应激、T淋巴细胞亚群及营养状态的影响*

目的:探讨百令胶囊联合左卡尼汀对维持性血液透析(MHD)患者氧化应激、T淋巴细胞亚群及营养状态的影响。方法:选取我院于2015年6月至2017年4月期间接受MHD治疗的慢性肾衰竭患者72例为研究对象。按照数表法将患者随机分为对照组(n=36)和实验组(n=36)。两组患者均行MHD治疗,实验组患者在此基础上给予百令胶囊联合左卡尼汀治疗,疗程均为6个月。比较两组治疗前、治疗6个月后的氧化应激指标:血浆丙二醛(MDA)、血浆谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPx)、血浆总高半胱氨酸(tHcy)水平,免疫功能指标:CD3~+、CD4~+、CD8~+、CD4~+/CD8~+,营养状态指标:血红蛋白(Hb)、白蛋白(Alb)、前白蛋白(PA)、总胆固醇(TCh)、三酰甘油(TG)、脂蛋白(a)[Lp(a)]。结果:两组患者治疗6个月后MDA、t Hcy水平下降,且实验组低于对照组(P0.05);治疗6个月后实验组患者GSHPx水平高于治疗前与对照组(P0.05),而对照组GSHPx水平与治疗前相比差异无统计学意义(P0.05)。治疗6个月后,实验组患者CD3~+、CD4~+、CD4~+/CD8~+水平高于治疗前及对照组,而CD8~+低于治疗前及对照组(P0.05)。实验组治疗6个月后Hb、Alb、PA水平高于治疗前及对照组,而Lp(a)低于治疗前及对照组(P0.05),实验组患者TCh、TG水平与治疗前比较差异无统计学意义(P0.05);对照组治疗6个月后Hb、Alb、PA、TCh、TG、Lp(a)水平与治疗前比较差异均无统计学意义(P0.05)。结论:百令胶囊联合左卡尼汀可减轻MHD患者氧化应激反应,调节T淋巴细胞亚群,同时改善患者营养状况,值得临床推广应用。