核定位信号肽提高核糖体区打靶载体转染效率的研究

核糖体区打靶载体(10～14 kb)是中南大学医学遗传学国家重点实验室构建的一种具有定点整合能力的非病毒载体,具有安全性好及长期稳定表达的特点,但是较低的转染率成为其应用于临床的主要障碍．核定位信号肽可以促进非病毒载体进入细胞核,从而提高其转染效率．但是核定位信号肽提高外源基因表达的能力却严重受到其与DNA偶联方式及偶联剂的影响．采用偶联剂SPB可以通过静电作用将核糖体区打靶载体与SV40 核定位信号肽有效结合,并且可以防止其被DNase降解．应用聚乙烯亚胺转染人原代皮肤成纤维细胞后,激光共聚焦显微镜观察显示,核定位信号肽可以在60 min内携带12 kb的质粒DNA进入细胞核．转染后48 h,流式细胞仪检测GFP表达,结果显示转染率提高了4～5倍．聚乙烯亚胺是一种毒性小,而且价格低廉的高分子转染试剂,广泛被应用于体内基因治疗的研究中,上述研究将会促进核糖体区打靶载体在临床基因治疗中的应用．     

青脆枝小枝的化学成分研究

对生长于云南省勐腊县的青脆枝小枝的化学成分进行分离鉴定。通过硅胶、MCI和Sephadex LH-20反复柱层析、纯化,从青脆枝小枝的90%甲醇提取物中分离得到19个化合物,运用现代波谱技术分别鉴定为:香树精(1)、7-酮基-β-谷甾醇(2)、豆甾醇(3)、谷甾-5-烯-3β,7β-二醇(4)、丙氧基香树精(5)、鹅掌楸碱(6)、松柏苷(7)、丁香酸葡萄糖苷(8)、丁香苷(9)、咖啡酸(10)、6,7-二羟基香豆素(11)、(3R)-3,6,7三甲基十九碳酸甲酯(12)、喜树碱(13)、9-甲氧基喜树碱(14)、10-羟基喜树碱(15)、麦黄酮(16)、豆甾-5-烯-3β,7α-二醇(17)、胡萝卜苷(18)、谷甾醇(19)。其中化合物1~12均为首次从该植物中分离得到。     

从小鼠大脑皮层制备高纯度胶质限制前体细胞

目的:探索一种简单易行的分离、制备高纯度胶质限制前体细胞(Glial restricted precursor,GRP)的方法.方法:利用胶质限制前体细胞与星形胶质细胞分层生长的特点,采用摇培的方法将吸附在星形胶质细胞上的GRP分离下来,再利用单克隆形成实验获得单细胞来源的细胞克隆,接着细胞免疫荧光和定向分化实验鉴定细胞种类.结果:经鉴定所形成的单克隆90％为胶质限制前体细胞,它们能够分化成星形胶质细胞和少突胶质细胞,而没有分化成神经元的潜能.结论:利用细胞分层生长的特点和单克隆形成可以简便的制备高纯度的胶质限制前体细胞.     

人核糖体DNA打靶载体介导mda-7基因对肝癌的体外基因治疗研究

人核糖体DNA打靶载体pHr是一种由中南大学医学遗传学国家重点实验室开发构建的针对人类基因组的同源重组质粒载体．利用pHr构建了一种mda-7/GFP融合基因的人源基因表达载体pHr-CMG,并研究了其在肝癌细胞系Bel-7402中的作用．利用荧光显微镜、RT-PCR和Western blotting检测了mda-7/GFP融合基因的表达;利用细胞周期分析、MTT和Hoechst33258染色研究了其在细胞中的作用．结果显示,pHr-CMG载体能在Bel-7402细胞中有效表达MDA-7/GFP融合蛋白,进而抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡,推测其可能是由载体表达了mda-7基因引起细胞在G2/M期累积所导致的．同时,实验结果证实了人核糖体DNA打靶载体系统以及pHr-CMG表达载体的有效性,为其在进一步基因治疗研究中的应用提供了理论和实验基础．     

以人皮肤成纤维细胞作为饲养层细胞培养人胚胎干细胞

目的：比较人皮肤成纤维细胞（humandermalfibroblasts,HDFs）与小鼠胚胎成纤维细胞（Mouseembryonicfibroblasts,MEFs）的增殖能力及研究人皮肤成纤维细胞作为饲养层支持人胚胎干细胞（humanembryonicstemcells,hESCs）未分化生长的能力。方法：利用组织贴壁法从人皮肤中分离出HDFs,通过细胞形态的观察和生长曲线的绘制比较HDFs与MEFs的体外增殖能力。将HDFs作为饲养层细胞与hESCs共培养,传代12代后,检测hESCs碱性磷酸酶（AKP）、表面特异性标志及胚胎干细胞特异性转录因子。结果：HDFs可连续传代培养15代以上,10代以下的HDFs增殖迅速,而MEFs自第4代起,增殖能力就明显下降;hESCs在HDFs饲养层上可传代培养12代以上,克隆边界清晰,细胞排列紧密,碱性磷酸酶、表面标志物检测均呈阳性,表达了hESCs特异性转录因子。结论：HDFs比MEFs具有更强的增殖能力;HDFs可作为培养hEscs的饲养层细胞。     

胎膜来源的间充质干细胞促进烧伤愈合的研究

目的:研究胎膜来源的间充质干细胞在治疗SD大鼠Ⅲ度烧伤中的作用.方法:用胰酶消化法分离足月产胎膜细胞,加入Amino-MAX Ⅱ培养基进行培养.流式细胞仪检测细胞表面标志物CD29、CD73、CDl4、CD45.分别用浓度为3mg/ml、5mg/ml、7mg/mi、9mg/ml的明胶溶液包被脱细胞真皮(ADM),以5x 106/ml的密度将细胞种植在包被和未包被的ADM表面,2小时后收集未贴附在ADM上的细胞,计算细胞种植效率.实验组:以7mg/ml的明胶包被ADM,以5x 106/ml的密度种植第2～3代细胞,培养3～5天后,移植至SD大鼠Ⅲ度烧伤创面;对照组Ⅰ移植单纯的ADM,对照组Ⅱ未进行移植,术后定期观察创面大体情况,计算创面收缩率、表皮再生面积比例,第5周切取新生皮肤组织行HE染色.结果:胎膜分离的细胞以长梭形为主,表达与间充质干细胞相关的表面抗原标志物CD29、CD73,极少表达造血细胞标志物CD14、CD45.不同浓度明胶溶液包被和未包被的ADM,其细胞种植效率均无明显区别(P>0.05);相比对照组,实验组移植物成活时间更长,创面再上皮化时间较早,创面收缩率较小,再生表皮面积亦较多(P<0.05);再生表皮更厚,有明显的表皮突,真皮层毛细血管丰富.结论:成功分离、培养了胎膜来源的间充质干细胞.胎膜来源间充质干细胞复合ADM可促进SD大鼠Ⅲ烧伤创面表皮再生,加速创伤愈合,抑制创面收缩.