十字花科黑腐病菌的XC1193基因与致病相关

十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc)是一种重要植物病原细菌,在全球范围内侵染十字花科植物引起黑腐病,其σ因子在基因表达中起到重要调节作用。XC1193基因在Xcc 8004菌株编码一个σ~70因子,为进一步研究该σ因子在Xcc中的调控作用,利用自杀质粒p K18mobsac B构建了XC1193基因的缺失突变体DM1193。与野生型菌株的比较发现,XC1193基因突变不影响菌体在丰富培养基和基本培养基上的生长;突变体的胞外蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶等生化表型也与野生型一致;植株实验表明XC1193突变不影响过敏反应。采用剪叶接种法进行致病性检测,突变体致病力与野生型一致。而采用喷雾接种法,突变体致病力显著降低,互补菌株致病力恢复至野生型水平。结果表明,该σ因子在十字花科黑腐病菌致病过程中发挥作用,并与Xcc侵染寄主的早期事件有关。     

野油菜黄单胞菌分泌组双向电泳样品制备方法的建立

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc)是十字花科植物黑腐病的病原细菌。我们建立了Xcc的蛋白质组学研究平台,用于分离、鉴定该菌的致病相关蛋白。为了减少胞外多糖(exopolysaccharide,EPS)对蛋白材料质量的影响,我们构建了EPS缺陷的Xcc8004ΔgumB突变体。本研究以Xcc8004ΔgumB出发菌株,用诱导培养液培养,取细胞上清通过超滤浓缩得到蛋白质粗提物,分别采用丙酮沉淀法、试剂盒纯化法和丙酮沉淀-试剂盒联用法来纯化蛋白质粗提物,通过比较双向电泳的结果优选最佳的样品制备方法。结果证明丙酮沉淀-试剂盒联用法较为理想,所得双向电泳图片清晰,分辨率高。因此,此方法可以用于制备野油菜黄单胞菌分泌组双向电泳样品,并可以满足进一步研究的需要。     

十字花科黑腐病菌分泌蛋白质双向电泳条件的构建及优化

本研究旨在建立一套适合于十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv.campestris 8004,Xcc8004)分泌蛋白质的双向电泳技术(two-dimensional electrophoresis,2-DE),以便更好的利用蛋白质组学技术鉴定Xcc 8004的分泌蛋白质。我们就MME和XCM2两种培养基对分泌蛋白质的诱导能力、蛋白质提取方法以及样品上样量等方面对2-DE的影响进行了比较,结果表明,XCM2培养基对Xcc 8004分泌蛋白质的诱导能力比MME强。用TCA/丙酮法沉淀蛋白质得到的双向电泳图谱背景清晰,分辨率高。分别采用400μg、300μg、250μg和150μg四个不同的上样量进行双向电泳,结果显示在上样量为250~300μg时(IPG p H 3-10,24 cm),电泳图谱分辨率最好。综上可知,XCM2培养基比较适合用于Xcc 8004分泌蛋白质的诱导,TCA/丙酮法提取分泌蛋白质为较优方法,250~300μg是较为合适的上样量。     

活性绿19修饰花生壳粉微球的制备及对溶菌酶的吸附

以天然产物花生壳粉作为基质,环氧氯丙烷为交联剂,活性绿19(Reactive Green 19,简称RG19)为修饰剂,制备了新型的生物吸附剂RG19修饰花生壳粉微球,比较了RG19修饰花生壳粉前后对溶菌酶的吸附性能,包括吸附溶液的pH,溶菌酶的初始浓度,吸附时间,温度及NaCl的浓度对吸附的影响。结果表明,用25.0 mgRG19修饰花生壳粉微球处理溶菌酶溶液10 mL,pH值7.4,吸附时间4 h的条件下,对溶菌酶的吸附量是149.6mg·g-1,其酶活力保持率为96.4%,而未修饰的花生壳粉微球对溶菌酶的吸附量只有23.6 mg·g-1,修饰后是修饰前的6.3倍。在上述条件下从鸡蛋清中分离纯化溶菌酶,纯化倍数为31.0,收得率为64.2%。而且该吸附剂的复用性好。     

人Nek2蛋白原核表达纯化及其多克隆抗体制备 *

目的通过原核表达系统表达人Nek2蛋白,优化表达条件并纯化Nek2蛋白,制备抗Nek2多克隆抗体.方法 将Nek2基因片段构建到原核表达载体pET30a(+)上,转化大肠杆菌BL21 (DE3);加入诱导剂IPTG诱导表达,对诱导温度,诱导剂IPTG终浓度,诱导时间等条件进行优化;利用12% SDS-PAGE后250mmol/L KCl染色切胶纯化蛋白质,将纯化后的Nek2蛋白进行质谱鉴定;纯化Nek2蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,运用ELISA,Western blot和免疫荧光实验检测多克隆抗体效价和特异性.结果 构建了pET30a(+)-Nek2重组原核表达质粒,诱导的重组人Nek2蛋白主要以包涵体的形式存在;蛋白质的最适诱导表达条件为28℃,180r/min条件下加入终浓度为0.2mmol/L IPTG诱导32h;质谱分析纯化后的蛋白质为Nek2蛋白,最终获得浓度为1.35mg/ml纯化后的Nek2蛋白;纯化蛋白免疫小鼠,多克隆抗体效价大于1∶243 000,且具有良好的抗原特异性;免疫荧光实验显示Nek2主要定位于细胞质和细胞核.结论: 利用重组人Nek2蛋白获得具有良好抗原特异性的抗Nek2多克隆抗体.     

十字花科黑腐病菌III型效应物基因avrACXcc8004推测的启动子区

摘要:【目的】十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv．campestris,Xcc),能侵染所有十字花科植物,引起黑腐病。Xcc通过III型分泌系统(Type III Secretion System,T3SS)将III型效应物(T3SS effector,T3SE)蛋白直接转运到植物细胞内,T3SEs对于病原菌致病性至关重要。许多已鉴定的T3SEs基因的启动子区都 存在植物诱导启动子盒(Plant-inducible promoter,PIP-box)和－10box,但PIP-box及－10 box与经典的启动子－10区及－35区之间的关系如何未见报道,－10 box的序列保守性如何也未见报道。本研究旨在对T3SE基因avrACXcc8004推测的启动子区进行研究。【方法】首先,通过5'RACE 确定其转录起始位点,接着用Fusion PCR对－10 box TACGTT序列中倒数第二个碱基T进行点突变为A/C/G,即:TACGAT、TACGCT和TACGGT,构建GUS融合报告菌株,定量测定GUS酶活。【结果】5'RACE结果显示avrACXcc8004的转录起始位点为A,对比分析得到启动子的－35区位于PIP-box之后8bp处,而－10区与－10 box重叠;avrACXcc8004启动子区的PIP-box和－35区、－ 10 box的整个模体为:TTCAC-N15 -TTCGC-N8 -TTGATG-N18 -TACGTT。最后,GUS定量测定结果表明,突变为C 时( TACGCT)的菌株的GUS 酶活最高,突变为G 时(TACGGT)的酶活增高最 少。在ΔhrpX 和ΔhrpG 中的GUS 酶活均比在Xcc 8004 中有显著的降低。【结论】Xcc 的T3SE 基因PIP-box与－35区前后相衔,－10 box即－10区,－10 box对于avrACXcc8004的转录活性有较大的影响,－ 10 box突变前后avrACXcc8004均受HrpG 和HrpX 正向调控。     

十字花科黑腐病菌Ⅲ型效应物基因avrAC_(Xcc8004)推测的启动子区

【目的】十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc),能侵染所有十字花科植物,引起黑腐病。Xcc通过III型分泌系统(Type III Secretion System,T3SS)将III型效应物(T3SS effector,T3SE)蛋白直接转运到植物细胞内,T3SEs对于病原菌致病性至关重要。许多已鉴定的T3SEs基因的启动子区都存在植物诱导启动子盒(Plant-inducible promoter,PIP-box)和-10 box,但PIP-box及-10 box与经典的启动子-10区及-35区之间的关系如何未见报道,-10 box的序列保守性如何也未见报道。本研究旨在对T3SE基因avrAC Xcc8004推测的启动子区进行研究。【方法】首先,通过5'RACE确定其转录起始位点,接着用Fusion PCR对-10 box TACGTT序列中倒数第二个碱基T进行点突变为A/C/G,即:TACGAT、TACGCT和TACGGT,构建GUS融合报告菌株,定量测定GUS酶活。【结果】5'RACE结果显示avrAC Xcc8004的转录起始位点为A,对比分析得到启动子的-35区位于PIP-box之后8 bp处,而-10区与-10 box重叠;avrAC Xcc8004启动子区的PIP-box和-35区、-10 box的整个模体为:TTCAC-N15-TTCGC-N8-TTGATG-N18-TACGTT。最后,GUS定量测定结果表明,突变为C时(TACGCT)的菌株的GUS酶活最高,突变为G时(TACGGT)的酶活增高最少。在ΔhrpX和ΔhrpG中的GUS酶活均比在Xcc 8004中有显著的降低。【结论】Xcc的T3SE基因PIP-box与-35区前后相衔,-10 box即-10区,-10 box对于avrAC Xcc8004的转录活性有较大的影响,-10 box突变前后avrAC Xcc8004均受HrpG和HrpX正向调控。     

十字花科黑腐病菌一个新的III型效应物XC3176的鉴定

摘要:【目的】在十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv． campestris,Xcc)的致病因子中,III型分泌系统(Type III Secretion System,T3SS)是至关重要的致病系统,III型效应物通过III 型分泌系统直接转运到寄主植物细胞内。本研究通过效应物水平转移的特征获得候选基因,旨在鉴定一个新的依赖于III型分泌的效 应物。【方法】以缺失了N-端58个氨基酸的AvrBs1作为报告系统构建效应物鉴定报告质粒pLJB3176,导入ΔavrBs1和ΔhrcV,通过检测报告菌株在辣椒ECW-10R上的过敏反应来鉴定XC3176是否为III型效应物。构建XC3176融合GUS报告质粒pLGUS3176,导入野生菌株Xcc 8004、ΔhrpG和ΔhrpX,通过测定菌株GUS活性检测hrpG、hrpX对XC3176 的调控作用。构建XC3176缺失突变体和互补菌株,通过剪叶法接种检测XC3176对Xcc 8004致病性的影响。【结果】XC3176融合AvrBs1报告菌株在非寄主辣椒ECW-10R上能 引发过敏反应,GUS活性检测显示ΔhrpG/pLGUS3176、ΔhrpX/pLGUS3176比8004/pLGUS3176的GUS酶活显著降低,致病性检测显示突变体Δ3176与野生型Xcc 8004相比在寄主满身红萝卜上的病斑长度有显著减少,互补菌株C3176 的病斑长度能补回到野生型水平。【结论】XC3176是依赖于hrcV分泌的III型效应物,hrpG、hrpX正调控XC3176,XC3176与Xcc致病相关。     

金属离子对十字花科黑腐病菌不同致病系统表达的影响

十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc)是引起十字花科植物黑腐病的病原细菌,其通过不同的分泌系统将效应物蛋白或细胞毒素转运进真核宿主细胞产生病害,对农业生产造成巨大的经济损失。本研究利用GUS融合报告系统,考察了常见的几种不同金属离子(Zn2+,Mn2+,Ca2+,Fe2+)对Xcc 8004不同致病系统装置基因表达的影响。结果表明,在1滋mol/L~1 mmol/L浓度区间,Zn2+和Mn2+同时对Xcc域型分泌系统(T2SS)和芋型分泌系统(T3SS)有抑制作用;在大于0.01 mmol/L浓度时,Ca2+特异性抑制T3SS;Fe2+同时抑制T2SS、T3SS和郁型分泌系统(T4SS)装置基因的表达。金属离子Zn2+、Mn2+、Ca2+和Fe2+在不同浓度下对Xcc的致病系统均有抑制作用。本研究为分析病原细菌不同分泌系统响应金属离子的模式奠定了基础。