46,XY女性性反转患者SRY基因的两个新突变类型

Y染色体上的性别决定区域——SRY基因作为睾丸决定因子,可以调控男性性别发育过程。SRY基因是一种转录因子,属于带有高迁移率族蛋白家族,该家族成员包含能与DNA结合的HMG盒基序。已知SRY基因的缺失和点突变是造成XY女性性反转的病因之一。通过筛查10位中国46,XY女性性反转病人SRY基因的开放阅读框区域,探寻新的突变类型。用标准方法从外周血中抽提gDNA,通过聚合酶链式反应扩增SRY基因中部的609bp的DNA片段。扩增后的PCR片段被克隆到pUCm-T载体中,在ABI377-3自动测序仪上完成测序。运用限制性内切酶酶切分析的方法验证DNA测序的结果。结果表明,在两个患者的SRY基因中分别发现了新的核苷酸点突变,并都导致氨基酸替代。一个突变发生在SRY基因的5’端HMG盒外的核苷酸第113位腺嘌呤(A)被鸟嘌呤(G)取代,并导致谷氨酸被甘氨酸替换;另一个突变是第387位核苷酸发生T被A替换,该突变引起第129位的酪氨酸变成终止密码,她父亲的SRY序列被证明是正常的野生型。通过查询文献和人类基因突变数据库(HGMD),这两个突变都是以前未见报道过的新型SRY基因突变,并使因核苷酸替换引起SRY基因突变总数增加到45。     

一个新的人类锌指蛋白基因ZNF474的cDNA克隆和表达分析

数据库消减杂交就是利用NCBI中的Unigene数据库中大量的数据资源,收集各种细胞或组织的基因表达谱进行两两比较或多重比较,获得两组文库间有统计学意义的差异表达基因。运用NCBI中的数据库消减杂交分析方法,从人睾丸组织中分离了一个含有C2H2结构的新型锌指蛋白基因-ZNF474(GenBank登录号：AY461732)．通过推导和进一步的RT—PCR实验证实：该基因含2个外显子,gDNA在染色体上跨度30065bp,定位于人染色体5q23．1-q23。2．cDNA编码一个含364个氨基酸的新蛋白,分子质量是40．3kDa,等电点为9．59。Northem杂交结果显示：该基因含有2．37kb大小的唯一转录本,主要在睾丸中很强表达,卵巢中有弱表达,而其他组织中该基因无表达．结果提示：ZNF474基因对精子发生和卵母细胞的发育可能起重要作用、     

人类生精相关基因TSARG4的cDNA克隆

为了探索精子生成的分子机制 ,从人精子外部致密纤维蛋白相关基因SPAG4(spermantigen 4)和小鼠精母细胞中表达的AK0 0 62 2 5基因出发 ,找到两个人类EST ,BG72 0 5 64和AI70 0 45 4,其中BG72 0 5 64在人睾丸中表达。运用“间隙填充法”填平这两个EST之间的间隙 ,从人睾丸文库中快速克隆了同源于SPAG4和AK0 0 62 2 5基因的人类TSARG4基因 (testisandspermatogenesisrelatedgene 4) (GenBank登录号为AF40 13 5 0 ) ,并用RT PCR对该基因阅读框进行验证。TSARG4基因全长 12 5 2bp ,开放阅读框为 94～ 12 3 3bp ,定位于 2 0q11.2 ,推定编码 3 79个氨基酸 ,预计分子量为 43 0 81.45 ,等电点为 8.61,该基因与小鼠精母细胞基因AK0 0 62 2 5编码的氨基酸序列同源性 74% ,与人类SPAG4基因编码的氨基酸序列同源性 45 %。RT PCR表明人类TSARG4基因在多个组织中均有表达 ,而同源的小鼠AK0 0 62 2 5基因仅在睾丸中表达     

用双色荧光愿位杂交和PCR技术鉴定无精症患者标记染色体的来源

目的：为了研究无精症患标记染色体的来源,对无精症患进行明确的遗传学诊断。方法：应用双色FISH技术和PCR技术对2例无精症患进行分子细胞遗传学和分子遗传学检测。结果：确定了两例特发性无精症患的标记染色体均来源于Y染色体,其核型为46,X,ishdel(Y)(q11)(DYZ3 ,DXZ1-)。结论：FISH技术结合PCR技术,是鉴定标记染色体来源的又一非常重要方法,对于无精症患在进行胞质内单精子注射（ICSI）或其它治疗之前,完成遗传咨询和明确的遗传学诊断也是特别必须的。     

六例性腺发育不全症的实验室及临床研究

腾那(Turner)在1938年描写了一种综合征,包括女性表型、性发育不良、原发性闭经、矮身材、颈蹼和肘外翻。Wilkins等在1944年发现这种病人具有条索状性腺。条索状性腺主要为结缔组织,并无卵巢滤泡,故称性腺发育不全症。Polani等在1954年证明这个综合征的大多数病例的x小体为阴性。Ford在1959年描述其核型为45,X0。由于上述的工作,使之对该病有了一个初步完整的概念。在国内吴曼等、湖南医学院遗传组     

一VHL 家系致病基因突变的检测与分析*

目的:研究中枢神经系统血管母细胞瘤(VHL)基因突变的主要类型和发生情况,探讨VHL疾病发生的原因、临床特点等。方法:以基因组DNA为模板,PCR扩增VHL基因3个外显子及5’UTR区域,结合DNA直接测序的方法,对一个有多个小脑血管母细胞瘤患者的家系进行VHL基因突变检测。结果:发现该家系VHL基因5’UTR区、外显子1和外显子2正常,外显子3存在c.499C>G的改变,为一个错意突变,氨基酸改变为Arg-Gln(p.R167Q),该突变是导致这个家系的患者发病的直接原因。结论:VHL疾病的突变主要集中在VHL蛋白的α、β结构域,位于α结构域的p.R167Q突变为该VHL家系致病的主要原因。     

利用电子差异展示方法克隆人类睾丸高表达新基因SPATA11

利用NCBI中的电子差异展示(digital differential display,DDD)软件,比较来自睾丸(包括睾丸癌)与来自其它组织的EST文库,从筛查人类睾丸中高表达而在其他组织中不表达或低表达的差异ESTs入手,成功克隆了一个在人类睾丸中高表达的新基因SPATA11．RT-PCR实验证实其在成人睾丸高表达．序列分析表明该基因含4个外显子,基因组跨越2．6kb,定位于19pl3．3．cDNA编码一个含221个氨基酸,相对分子质量为24．5kD的新蛋白．Northern杂交结果显示：该基因含有1．1kb大小的唯一转录本,主要在睾丸中强表达．肝脏、肺、卵巢和肾脏中有微弱表达．而其他组织中该基因无表达．     

用RAPD技术检测不同生态类型蜘蛛代表品种的基因组DNA多态性

蜘蛛有3种生态类型,即洞穴型、结网型和游猎型。利用RAPD技术检测3种生态类型蜘蛛的代表品种,即白额巨蟹蛛(游猎型)、漏斗蛛(结网型)、虎纹捕鸟蛛和七纺器蛛(洞穴型)的基因组DNA的多态性。用11个随机引物对3种生态类型的代表蜘蛛的基因组DNA进行扩增,平均每个品种观察到约22.5个标记,单个引物获得的标记在4～13个之间。实验结果经统计学分析表明,L纺器蛛和虎纹捕鸟蛛的随机扩增多态DNA共享度(F)高,在分子水平上进一步证实了同生态类型蜘蛛的亲缘天系最近,聚类结果表明,3种类型蜘蛛的总体演化趋势为:洞穴型 结网型—游猎型,与以往的形态学研究相符。     

人DDX36和小鼠Ddx36基因在成年睾丸组织中的表达研究

果蝇是结构基因组学和功能基因组学研究的最为理想的一种模式生物,采用同源克隆的策略,应用生物信息学分析和实验技术相结合的方法分别从人和小鼠中克隆了同源于果蝇MLE蛋白的新基因DDX36和Ddx36。为进一步研究DDX36和Ddx36基因与精子发生的关系,再应用Northrn blotting,RT-PCR和组织原位杂交技术探讨了DDX36和Ddx36基因的表达情况,结果发现人DDX36和小鼠Ddx36基因在成年睾丸组织中高表达。初步证明DDX36和Ddx36基因在精子发生中亦可能发挥重要作用。     

小鼠睾丸生精细胞凋亡相关基因SRG2的分子克隆及其在隐睾中的表达特征

从已获得的在隐睾和正常睾丸对照中表达量有明显差异的EST片段(BE644542)入手,利用网上生物信息学克隆了SRG2基因全长,GenBank登录号为AF395083。从小鼠睾丸cDNA文库中分离出该基因完整阅读框cDNA,SRG2基因的cDNA全长为1088bp,为编码295个氨基酸、分子量为33579kD、等电点为9．64的蛋白质,与人类同源基因TSARG2相似性为78％,而与其他已知蛋白质无明显同源性。RT-PCR结果表明：该基因只在睾丸中有高表达。应用新型的分子信标检测该基因在不同时期隐睾中的mRNA表达水平,发现该基因呈明显上调,证明该基因在隐睾的发生发展中具重要作用。