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目的:利用毕赤酵母表达具有生物学活性的蛇毒类凝血酶安克洛。方法:根据已知的天然安克洛的氨基酸序列,结合酵母偏好密码子,设计并合成了安克洛基因序列,将其克隆至表达载体pPIC9中,得到表达质粒pPIC9/Ancrod,电转至毕赤酵母GS115(His-)菌株感受态中,通过表达筛选获得工程菌株。采用5L发酵罐对工程菌进行发酵,表达安克洛。在诱导表达阶段,补加甲醇-山梨醇混合碳源。经疏水柱、肝素亲和柱和阳离子柱三步分离纯化得到重组安克洛,并鉴定其体外生物学活性。结果:重组安克洛表观相对分子质量为43000~48000,其糖基化不均匀,去糖基后蛋白肽链的相对分子质量约29000。重组安克洛被证明具有降解并凝固牛纤维蛋白原的活性,其比活力与天然安克洛相近。结论:采用毕赤酵母表达系统表达并获得有生物学活性的重组安克洛,为大规模生产打下了基础。 相似文献
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核酸适配体是利用配体指数富集的系统进化技术(SELEX)从随机文库中筛选获得一段有功能的单链寡核苷酸。但因筛选过程中的文库选择、洗涤次数、分离效率、缓冲液离子含量和pH值等多种因素的影响,迄今所报道的亲和力与特异性都很高的核酸适配体为数不多。初始文库是核酸适配体筛选的源头,作为SELEX技术的根本,其设计是否合理直接影响到筛选的成败和效率。分子模拟能以核酸适配体文库为主体,计算机为主要工具,发展多种结构模拟与分析工具,辅助核酸适配体文库的合理设计。本文综述了现阶段利用分子模拟进行核酸适配体初始文库设计的相关方法,希望能为从源头上提高核酸适配体筛选的成功率提供线索。 相似文献
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重组巴曲酶在毕赤酵母中的高效表达 总被引:4,自引:0,他引:4
以毕赤酵母为表达系统,建立生产重组巴曲酶的技术工艺路线。通过递归式PCR的方法,人工合成了巴曲酶基因,将其插入pPIC9表达质粒中,转化至毕赤酵母GS115(his4),筛选出的表达株经甲醇诱导,表达了重组巴曲酶,并得以纯化。从每升发酵液中可纯化得到10mg重组巴曲酶,其比活为238NIHunits/mg,分子量为30.55kD。重组巴曲酶在体外可使纤维蛋白凝固,在体内缩短小鼠出血时间。为开发重组的蛇毒类凝血酶止血剂打下了基础。 相似文献
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旨在利用细胞穿膜肽TAT的穿膜作用和细胞珠蛋白(Cytoglobin,Cygb)的抗衰老、抗纤维化的功能,将二者通过基因工程的手段融合在一起,以期获得能够穿透细胞屏障的Cygb。通过两次重叠PCR技术获得了TAT-Cygb DNA,将其插入原核表达载体pET22b质粒中,转化至大肠杆菌BL-21,筛选出可表达TAT-Cygb融合蛋白的大肠杆菌工程菌株。经乳糖诱导表达TAT-Cygb,CM阳离子交换层析(CM Sepharose Fast Flow Protocol)获得纯度高达95%的TAT-Cygb融合蛋白,分子量约23 kDa。生物活性实验显示,TAT-Cygb过氧化物酶比活力达到(422.30±0.36)U/mg。TAT-Cygb预处理的Hacat细胞可免受H2O2氧化应激的损伤(RGR=100%),同时TAT-Cygb可治疗已被H2O2氧化损伤的细胞(RGR=98%),与Cygb处理组相比具有显著差异(RGR=79%)。该研究首次成功利用大肠杆菌表达系统表达了可穿透细胞膜的、有生物活性的TAT-Cygb融合蛋白,为继续开展Cygb在抗衰老、抗纤维化和抗癌领域的研究奠定了基础。 相似文献
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为揭示细胞珠蛋白对肝星状细胞氧化损伤的保护作用及相关机制,通过siRNA干扰内源性细胞珠蛋白基因,利用重组细胞珠蛋白作用于完全活化的人肝星状细胞系LX-2及大鼠原代肝星状细胞,并在LX-2细胞内过表达细胞珠蛋白,考察在过氧化氢及铁过载两种不同作用机制的氧化反应模型中细胞的增殖性及细胞内超氧化物水平。结果表明内源性细胞珠蛋白对于两种氧化反应导致的肝星状细胞损伤都具有显著性的保护作用,证明其在活化肝星状细胞内的表达上调是其应对氧化应激的保护性措施;重组细胞珠蛋白不仅能保护完全活化的LX-2细胞免受氧化应激损伤,并且能抑制未完全活化的原代肝星状细胞过度增殖以及保护其被过度损伤;重组细胞珠蛋白对细胞内的活性氧清除效果不理想,可能与其进出细胞缺乏相应的主动运输机制有关。进一步在LX-2细胞内过表达细胞珠蛋白对无论是铁过载或是过氧化氢引起的氧化反应均能发挥较好的保护性作用。为加速肝纤维化药物新靶点开发提供了理论依据。 相似文献
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