迷迭香酸抗穿透支原体脂蛋白诱导巨噬细胞凋亡的作用研究

探讨迷迭香酸对穿透支原体脂蛋白诱导巨噬细胞凋亡的保护作用。方法:以穿透支原体脂蛋白损伤RAW264．7细胞为模型,用MTT法检测细胞存活状况,DNA片断化分析观察穿透支原体脂蛋白对RAW264．7细胞DNA降解的影响,碘化丙啶染色流式细胞术检测细胞凋亡率。结果:7．5mg/L穿透支原体脂蛋白可引起RAW264．7细胞存活率降低,出现细胞凋亡特征性“DNA梯带”,流式细胞术检测细胞出现凋亡亚G1期峰,凋亡率为31．9%;100μmol/L迷迭香酸预处理1小时后可以升高RAW264．7细胞的存活率,凋亡细胞特征性的梯状梯带消失,细胞凋亡亚G1期峰消失,并使RAW264．7细胞的凋亡率下降为7．9%。结论:迷迭香酸有抗穿透支原体脂蛋白诱导RAW264．7细胞凋亡的作用。     

Daxx通过上调caveolin-1的表达介导Ox-LDL诱导巨噬细胞胆固醇蓄积和凋亡

为探讨Daxx对氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,Ox-LDL)诱导巨噬细胞胆固醇蓄积和凋亡的介导作用及其可能的分子机制,用高效液相色谱法检测细胞内胆固醇含量,油红O染色观察细胞内脂滴的形成情况,流式细胞术和吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)染色法研究Ox-LDL对细胞凋亡的影响,Real time RT-PCR检测细胞内Daxx mRNA的表达水平,Western blot检测caveolin-1蛋白的表达,用特异性siRNA沉默Daxx在RAW264.7 细胞中的表达．Ox-LDL上调Daxx mRNA和caveolin-1的表达、增加细胞内胆固醇含量、促使RAW264.7细胞凋亡,用特异性siRNA干扰Daxx在RAW264.7细胞中的表达能降低caveolin-1的表达、减少细胞内胆固醇含量、以及抑制细胞凋亡．上述结果表明,Daxx对Ox-LDL诱导RAW264.7巨噬细胞胆固醇蓄积和凋亡具有介导作用,这一作用可能与Daxx上调caveolin -1的表达有关．     

Daxx过表达对氧化应激诱导的肝肿瘤细胞凋亡的影响

死亡结构域相关蛋白Daxx可以敏化多种肿瘤细胞的凋亡过程,但对于肝肿瘤细胞株HepG2的影响未见报道．为了研究Daxx增加肝HepG2细胞对药物敏感性的影响及机制,为开发药物新的药理作用提供理论依据,分别转染pEGFP-C1和pEGFP-C1-Daxx这两个载体到HepG2细胞．实验分组如下：（1）正常对照组（未转染细胞组）;（2）pEGFP-C1空载体转染组（HepG2/GFP细胞）;（3）pEGFP-C1-Daxx表达载体转染组（nepG2/GFP-Daxx细胞）．筛选稳定细胞株,用逆转录聚合酶链反应检测mRNA的表达;用过氧化氢孵育24h诱导细胞凋亡,采用MTT法和流式细胞术检测细胞凋亡率,Western blot检测蛋白质的表达．经G418筛选稳定的细胞运用RT-PCR技术分析其mRNA,结果显示,转染绿色荧光蛋白Daxx表达载体的细胞Daxx的mRNA明显上调：用荧光显微镜观察到Daxx蛋白主要定位于细胞核．用过氧化氢诱导HepG2细胞凋亡,观察到过氧化氢呈浓度依赖性地抑制HepG2细胞活性．正常对照细胞、HepG2／GFP、HepG2／GFP-Daxx 3组细胞的IC50值分别是0．72、0．76、0．49mmol／L．并且运用流式细胞仪检测到HepG2／GFP-Daxx组细胞凋亡率明显高于转染空载体质粒组与未转染组（（42．9±8．42）vs（27．3±6．38）or（28．5±4．71））．提示HepG2/GFP-Daxx细胞对过氧化氢的反应性较未转染细胞和HepG2/GFP敏感．还运用Western-blot检测到活化的caspase3在Daxx转染组细胞表达最强,达到（204．66±19．68）％,而未转染和HepG2/GFP组细胞分别是（100±3．1）％、（107．39±20．1）％,进一步说明了Daxx可以增加HepG2细胞对于过氧化氢的敏感性．同时,观察到过氧化氢处理24h后,Daxx转染组细胞磷酸化的JNK表达明显高于空载体转染组和未转染细胞组．上述结果表明：a．Daxx可以增加肝HepG2细胞对过氧化氢诱导的细胞凋亡敏感性;b．Daxx蛋白敏化过氧化氢诱导的HepG2细胞凋亡可能与协同增加JNK活性有关．     

高静水压培养对内皮酯酶表达的影响

探讨高静水压培养对内皮脂酶表达的影响及其机制．分大气压(0 mmHg)和高于1个标准大气压的递增压力(120、150、180 mmHg)培养人脐静脉内皮细胞,用蛋白酶体抑制剂MG132进行干预．RT-PCR检测内皮脂酶 mRNA的表达,间接免疫荧光技术和流式细胞术检测内皮脂酶蛋白的表达．结果显示,高静水压培养明显促进内皮脂酶mRNA和蛋白质的表达,180 mmHg培养24 h内皮脂酶mRNA的表达较对照组上调2.2倍(P < 0.001),内皮脂酶蛋白表达较对照组上调2.54倍(P < 0.001)．蛋白酶体抑制剂MG132干预明显抑制180 mmHg培养诱导的内皮脂酶 mRNA的表达,MG132干预组内皮脂酶mRNA表达约为180 mmHg培养组的50% (P < 0.05)．结果说明,高静水压上调内皮脂酶 mRNA和蛋白质的表达,其机制可能与核因子-κB活化有关．     

溶血卵磷脂及其受体GPR4对HUVEC的增殖及caspase3前体表达的影响

目的：研究溶血卵磷脂（lysophosphatidylcholine,LPC）及其受体GPR4（G protein-coupled receptor 4,GPR4）相互作用后对人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVEC）增殖的影响及其凋亡的诱导。方法：采用脂质体2000将装有GPR4受体基因的pEFneo真核表达载体转染HUVEC,并通过G418（800pg／ml）筛选获得GPR4基因稳定表达细胞株;RT—PCR法检测转染前后GPR4受体的mRNA水平表达情况;MTT法检测细胞的生长活力;AO染色法观察LPC对HUVEC造成损伤后形态的改变;Western blot法检测LPC与其受体相互作用后对caspase-3前体表达的影响。结果：成功获得了GPR4基因稳定表达细胞株;随着LPC浓度的增加（0．5,1,2,4,8pmoH）,抑制率分别增加了3．1％,4．4％,9．3％,17．0％,25．7％;但caspase-3前体的表达却随着浓度的增加先增加后减少。结论：LPC及其受体GPR4相互作用后可抑制HUVEC的增殖,并对HUVEC造成损伤进而诱导凋亡．使caslaase-3前体的表达先增加后减少。     

survivin在二烯丙基二硫诱导HepG2细胞凋亡中的作用

目的:研究survivin在二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)诱导HepG2细胞凋亡中的作用。方法:MTT法检测细胞的生长活性;流式细胞仪检测细胞周期;RT-PCR法检测survivin mRNA水平;Western blot法检测survivin蛋白水平。结果:用药组HepG2细胞活性与正常组相比,随着药物浓度的增加(25,50,100,200μmol/l),分别下降了9．3%、10．4%、21．6%、31．2%,HepG2细胞凋亡率分别增加0．83%、1．97%、6．0%、9．9%,低浓度(25,50μmol/l)的DADS可以诱导survivin mRNA和蛋白表达升高,而高浓度的(100,200μmol/l)DADS可以降低survivin mRNA和蛋白表达。结论:DADS诱导HepG2细胞survivin表达增加,抵抗DADS诱导HepG2细胞的凋亡作用。     

溶血卵磷脂及其受体GPR4对HUVEC的增殖及caspase 3前体表达的影响

研究溶血卵磷脂(lysophosphatidylcholine,LPC)及其受体GPR4(G protein-coupled receptor4,GPR4)相互作用后对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)增殖的影响及其凋亡的诱导。方法:采用脂质体2000将装有GPR4受体基因的pEFneo真核表达载体转染HUVEC,并通过G418(800μg/ml)筛选获得GPR4基因稳定表达细胞株;RT-PCR法检测转染前后GPR4受体的mRNA水平表达情况;MTT法检测细胞的生长活力;AO染色法观察LPC对HUVEC造成损伤后形态的改变;Western blot法检测LPC与其受体相互作用后对caspase-3前体表达的影响。结果:成功获得了GPR4基因稳定表达细胞株;随着LPC浓度的增加(0．5,1,2,4,8μmol/1),抑制率分别增加了3．1%,4．4%,9．3%,17．0%,25．7%;但caspase-3前体的表达却随着浓度的增加先增加后减少。结论:LPC及其受体GPR4相互作用后可抑制HUVEC的增殖,并对HUVEC造成损伤进而诱导凋亡,使caspase-3前体的表达先增加后减少。     

敌百虫对兔食饵性动脉硬化加速作用

目的:观察低剂量敌百虫对高脂模型兔动脉粥样硬化的作用.方法:新西兰兔32只,随机分为A组:喂饲高脂高胆固醇饲料加敌百虫清晨空腹灌胃(18mg·kg-1·d-1);B 组:单纯喂饲高脂高胆固醇饲料.检测喂饲饲料前和喂饲后5周、10周、15周血清PON1、胆碱酯酶(CHE)、血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、C反应蛋白(CRP)和血糖(GLU):实验第5周、第10周每组处死5只兔,第15周处死全部剩余兔,取主动脉全段,苏丹Ⅳ染色,Photoshop系统测定粥样斑块面积占内膜面积的百分比:检测肝PON1活性及血管内皮依赖性舒张功能(EDRR).结果:喂饲高脂高胆固醇后,A组和B组动物的TC、TG、HDL、LDL、CRP、GLU水平明显增高,但A、B组检测值差异无显著意义(P＞0.05);血清PON1、肝PON1活性降低,但A组PON1活性明显低于B组(P＜0.05);A组和B组动物主动脉EDRR均降低,A组EDRR降低大于B((P＜0.05);喂饲高脂高胆固醇饲料各组动物主动脉均见粥样硬化斑块形成,但A组动脉粥样斑块面积/内膜面积百分比明显高于B组(P＜0.05).结论:敌百虫加速实验性高脂血症动物动脉粥样硬化斑块形成,其机制可能与降低PONl活性有关.     

二烯丙基二硫诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡及机制的研究

目的:研究二烯丙基二硫(DADS)诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡及其分子机制。方法:AO／EB荧光染色法、流式细胞仪检测细胞凋亡率;Western blot法检测DADS对caspase-3剪切片断的影响,及对MAPKs通路相关蛋白,包括p-JNK、JNK表达的影响。结果:DADS对乳腺癌细胞株MCF-7生长具有明显的抑制作用,经AO／EB形态变化分析,可见明显的细胞凋亡特征;DADS处理MCF-7细胞6、12、24、48 h,流式细胞仪检测细胞的凋亡率分别为3．74％、9．22％、20.2％、42％,而对照组细胞的凋亡率仅为3．03％(P<0．05);不同浓度的DADS作用于MCF-7细胞24 h后,Western blot法检测发现caspase-3出现断裂片断,并随着浓度的增加断裂更明显。进一步研究发现,DADS处理MCF-7细胞后,JNK磷酸化水平明显升高。结论:DADS能诱导乳腺癌细胞株MCF-7细胞凋亡,JNK信号通路抑制可能是DADS诱导其调亡的分子机制之一。     

利用hTM表达细胞株制备抗人血栓调节蛋白单克隆抗体

为了研制抗人血栓调节蛋白(hTM)的单克隆抗体(mAb),给经CHO细胞免疫的BALB/c小鼠腹腔注射环磷酰胺诱导其对CHO和CHO-TM5细胞的共同抗原表位产生免疫耐受,再用高效表达hTM的CHO-TM5常规免疫小鼠．细胞融合后,ELISA筛选分泌抗hTM的特异性mAb阳性克隆,并将其腹腔注射BALB/c小鼠诱生腹水．腹水中的mAb经亲和层析纯化后,采用ELISA、流式细胞术、免疫组织化学染色法及Western blotting对其进行特异性鉴定．结果显示,共获得了5株阳性克隆,其中2F7可稳定分泌IgG1亚型的mAb,腹水抗体效价为1×10_-6,含量为19.56 g/L．2F7在体内与正常组织的交叉反应极少,对HUVEC、CHO-TM5有特异性结合,并可识别细胞裂解液还原条件下分子质量为105 ku左右的蛋白质多肽．2F7的解离常数K_d约为1.22×10_-9 mol/L．实验结果表明,通过采用新的技术路线,直接应用hTM表达细胞株免疫小鼠,成功制备了具有高度特异性与高亲和力的抗hTM mAb,为其他来源困难的蛋白质mAb制备提供了可借鉴的技术方案,同时2F7的研究鉴定为进一步应用抗hTM mAb进行hTM生物学功能及临床意义研究提供了新的物质基础．