登革病毒2型E蛋白基因真核表达和DNA免疫的研究

将编码登革病毒2型(DV2)氨基末端80%的E蛋白的DNA片段克隆到真核表达载体pCXN2 AG强启动子下游,构建成DV2E重组真核表达质粒pCXN-E.间接免疫荧光显示其可在COS-7细胞中表达.ELISA法检测pCXN2-E DNA免疫BALB/c鼠血清中的E抗体变化和维持规律,结果显示三次免疫后2周已有抗体产生,15周时仍维持较高的水平;血清空斑减数中和实验显示其中和滴度高于1640;流式细胞计数仪(FACS)检测DNA免疫鼠CD4+、CD8+T淋巴细胞变化情况,与注射空载体pCXN2的阴性鼠相比,CD4+淋巴细胞水平略有上升,CD8+细胞水平有较大升高(p＜0.01);动物保护性实验结果显示,当用致死剂量登革病毒攻击免疫鼠时,其保护率为60%.以上结果表明pCXN2-E在实验动物内表达出的DV2E蛋白可以诱导免疫动物的体液免疫和细胞免疫应答,尤其是MHC-Ⅰ限制性杀伤性CD8+T淋巴细胞水平的提高对清除病毒是十分有利的.因此,DV2 E DNA免疫为登革病毒DNA疫苗的发展进行了有益的探索.     

4株具有荚膜的白假丝酵母菌的分离与鉴定

取临床标本（性病门诊病人阴道分泌物）直接涂片染色镜检及用沙保氏琼脂平板分离培养、作涂片革兰染色镜检、出芽试验、厚膜孢子形成试验、糖发酵试验等鉴定菌种;小白鼠与家兔试验、荚膜肿胀试验、透射电镜等观察荚膜,观察白假丝酵母菌临床分离菌株（C1-1、C1-2、C1-3、C1-4）的荚膜结构并探讨其形成条件。结果显示：（1）C1-1、C1-2、C1-3、C1-4四株临床分离菌株均为革兰阳性、念珠状菌;能形成芽管、假菌丝、厚膜孢子;能发酵葡萄糖和麦芽糖产酸又产气;发酵蔗糖产酸不产气;不发酵乳糖。（2）在感染小白鼠及家兔体内均可形成荚膜,荚膜层的厚度可因不同环境而有显著差异（P〈0．01或〈0．05）,边界明显;荚膜肿胀试验阳性。4株临床分离菌株均可被鉴定为具有荚膜的白假丝酵母菌。     

登革2型病毒结合血管内皮细胞分子机制的初步研究

以ECV304细胞为对象分析登革病毒感染血管内皮细胞的机制.2型登革病毒(DEN2)吸附后微量蚀斑法测定ECV304细胞上清释放的病毒滴度,证实该细胞对DEN2感染有一定的敏感性.机械刮取或胰蛋白酶消化法收集ECV304细胞分离膜蛋白,SDS-PAGE见胰酶处理样品缺失一43 kDa的膜蛋白.将ECV304细胞膜蛋白与35S-Met标记的DEN2进行病毒重叠蛋白结合试验(VOPBA),有29、34和43 kDa的3种膜蛋白可与DV结合,其中29 kDa的蛋白对胰酶耐受.培养的ECV304细胞中加入重组E蛋白(rEgp)对DEN2吸附进行阻断试验,微量蚀斑法与间接免疫荧光表明rEgp抑制DEN2感染该细胞.VOPBA中rEgp可阻断病毒与细胞膜蛋白的结合.结果表明ECV304细胞表面可能存在29、34、43 kDa的3种与DEN2结合的相关蛋白,DEN2 E蛋白可直接介导DV感染血管内皮细胞.     

登革病毒2型E蛋白基因真核表达和DNA免疫的研究

将编码登革病毒2型(DV2)氨基末端80％的E蛋白的DNA片段克隆到真核表达载体pCXN2 AG强启动子下游,构建成DV2E重组真核表达质粒pCXN-E。间接免疫荧光显示其可在COS-7细胞中表达。ELISA法检测pCXN2-E DNA免疫BALB/c鼠血清中的E抗体变化和维持规律,结果显示三次免疫后2周已有抗体产生,15周时仍维持较高的水平;血清空斑减数中和实验显示其中和滴度高于1:640;流式细胞计数仪(FACS)检测DNA免疫鼠CD4~+、CD8~+T淋巴细胞变化情况,与注射空载体pCXN2的阴性鼠相比,CD4~+淋巴细胞水平略有上升。CD8~+细胞水平有较大升高(p<0.01);动物保护性实验结果显示,当用致死剂量登革病毒攻击免疫鼠时,其保护率为60％。以上结果表明:pCXN2-E在实验动物内表达出的DV2E蛋白可以诱导免疫动物的体液免疫和细胞免疫应答,尤其是MHC-I限制性杀伤性CD8~+T淋巴细胞水平的提高对清除病毒是十分有利的。因此,DV2 E DNA免疫为登革病毒DNA疫苗的发展进行了有益的探索。     

登革2型病毒结合血管内皮细胞分子机制的初步研究

以ECV304细胞为对象分析登革病毒感染血管内皮细胞的机制。2型登革病毒(DEN2)吸附后微量蚀斑法测定ECV304细胞上清释放的病毒滴度,证实该细胞对DEN2感染有一定的敏感性。机械刮取或胰蛋白酶消化法收集ECV304细胞分离膜蛋白,SDS—PAGE见胰酶处理样品缺失一43 kDa的膜蛋白。将ECV304细胞膜蛋白与^35S—Met标记的DEN2进行病毒重叠蛋白结合试验(VOPBA),有29、34和43kDa的3种膜蛋白可与DV结合,其中29 kDa的蛋白对胰酶耐受。培养的ECV304细胞中加入重组E蛋白(rEgp)对DEN2吸附进行阻断试验,微量蚀斑法与间接免疫荧光表明rEgp抑制DEN2感染该细胞。VOPBA中rEgp可阻断病毒与细胞膜蛋白的结合。结果表明ECV304细胞表面可能存在29、34、43 kDa的3种与DEN2结合的相关蛋白,DEN2E蛋白可直接介导DV感染血管内皮细胞。