转录抑制因子GCF2促进肝癌细胞BEL-7404迁移相关靶基因的初步鉴定

GCF2是转录抑制因子,为了研究GCF2蛋白在肝癌细胞BEL-7404迁移中的作用,并根据芯片结果验证GCF2调控参与迁移的靶基因,我们采用siR NA沉默GCF2蛋白表达,然后通过transwell实验检测GCF2沉默前后BEL-7404细胞迁移的变化,最后荧光定量RT-PCR和Western blot验证芯片结果中与迁移相关基因的表达。研究结果显示siR NA干扰GCF2成功后进行迁移实验,si RNA-GCF2组,FAM-siR NA-NC组,脂质体组,和未处理野生型BEL-7404组24 h后细胞穿过8滋m微孔滤膜的数目(x±s)分别为41.66±1.52、41.66±1.15、41.33±1.5、18.66±0.577,差异均有统计学意义(p约0.01)。QRT-PCR验证9个候选基因中,MyD 88在si RNA-GCF2组内表达显著高于其余三组(p约0.05)。Western blot检测siR NA干扰GCF2后肝癌细胞BEL-7404的MyD 88的蛋白表达显著高于其余三组(p约0.05)。结果表明si RNA沉默转录因子GCF2蛋白表达可抑制肿瘤细胞BEL-7404迁移,推测GCF2作为转录因子可能通过抑制靶基因MyD 88的表达参与细胞的迁移。     

肝癌细胞株中动力素kinectin基因mRNA的表达及临床意义探讨

运用重组克隆抗原表达的血清学鉴定（serologic alanalysis of recombinant cDNA expression libraries,SEREX）技术,本课题组从广西肝细胞癌（HCC）患者血清中筛选出系列相关抗原,其中一种抗原与人类动力素（kinectin）结构同源,且初步的检测表明,其相应抗体在HCC病人中有较高的特异性和阳性率,且与AFP有一定的互补性。     

毒素蛋白CcdB在载体构建中的研究及应用

大肠杆菌毒素-抗毒素系统ccd(control of cell division or death system)编码的毒素蛋白CcdB使细胞内DNA促旋酶失活,杀伤宿主细胞,而抗毒素蛋白CcdA可以中和毒素CcdB使宿主存活。利用这个原理,CcdB可作为细菌转化时的筛选标记,在构建各种高效低背景载体上发挥重要作用。我们简要综述毒素蛋白CcdB的毒性原理及其在质粒载体构建中的广泛应用。     

大肠杆菌转录后调控蛋白CsrA的C末端具有抑制十字花科黑腐病菌胞外蛋白酶活性的功能

CsrA(在有些细菌例如十字花科黒腐病菌中也称为RsmA,统称CsrA/RsmA)是一类在细菌中广泛分布而且氨基酸序列非常保守的RNA结合蛋白。研究表明,CsrA/RsmA作为转录后全局调控因子参与了包括细胞碳代谢、次生代谢、运动性、生物被膜形成以及动植物病原菌的致病过程等许多细胞过程的调控。CsrA/RsmA在不同的细菌中的生物学功能各有异同。在大肠杆菌中,CsrA的主要功能是控制细胞的碳代谢、运动性和生物被膜形成;而在十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pathovar campestris,Xcc)中,CsrA的同源蛋白RsmA的主要功能除了控制碳代谢、运动性和生物被膜形成外,还控制致病性和胞外酶的产生。大肠杆菌的CsrA(CsrAE.coli)是否具有XccRsmA(RsmAXcc)的功能?为了回答这个问题,我们用大肠杆菌的csrA基因(csrAE.coli)互补Xcc的rsmA基因(rsmAXcc)的缺失突变体DM2506。结果显示,csrAE.coli能够互补DM2506的所有表型,说明CsrAE.coli具有RsmAXcc的全部功能。更重要的是,我们发现,无论是rsmAXcc突变体还是野生型菌株,导入表达CsrAE.coli的质粒后均导致其致胞外蛋白酶活性的严重下降,证明CsrAE.coli具有抑制Xcc胞外蛋白酶活性的作用。进一步的实验证实,CsrAE.coli的C末端第53～61位氨基酸残基具有抑制Xcc胞外蛋白酶活性的功能。     

大肠杆菌全局调控蛋白CsrA中抑制十字花科黑腐病菌胞外蛋白酶活性所必需的氨基酸残基的鉴定

CsrA/RsmA蛋白家族是细菌中一类重要的转录后全局调控因子,它们调控细菌的碳代谢、次生代谢、运动、生物被膜形成以及致病等过程。CsrA/RsmA蛋白家族通常由60~72个氨基酸基组成,其中第1至第52位氨基酸高度保守,而第53位以后的氨基酸则高度可变。目前人们认为其氨基酸高度保守性是不同种属细菌CsrA/RsmA功能和作用机理相似的基础,但是其高度可变区与不同种属CsrA/RsmA蛋白功能差异的关系尚不清楚。我们之前的研究显示,大肠杆菌(Escherichia coli)的CsrA(CsrAE.coli)蛋白的高度可变区(第53至第61位氨基酸残基)具有强烈的抑制十字花科黒腐病菌(Xanthomonas campestris pathovar campestris,简称Xcc)胞外蛋白酶活性的能力。本研究中,我们采用丙氨酸置换方法,确定了CsrAE. coli可变区中抑制Xcc胞外蛋白酶活性必需的氨基酸残基。结果显示,CsrAE. coli蛋白的第54位赖氨酸(K54)、第60位丝氨酸(S60)和第61位酪氨酸(Y61)置换成丙氨酸后,CsrAE. coli蛋白丧失了抑制Xcc胞外蛋白酶活性的能力;而其它位点的丙氨酸置换不影响其抑制Xcc胞外蛋白酶活性的能力。这个结果证明K54、S60和Y61是CsrAE. coli抑制Xcc胞外蛋白酶活性所必需的,为揭示大肠杆菌的CsrA E.coli蛋白抑制Xcc胞外蛋白酶活性的分子机理奠定基础。