DCCD对植物乳杆菌H~+-ATPase活性及基因表达水平的影响

研究添加外源抑制剂双环己基碳二亚胺(DCCD)对植物乳杆菌H~+-ATPase基因表达水平及酶活力的影响,探讨植物乳杆菌H~+-ATPase的调控机制。分别测定加入DCCD前后的亲本菌和低H~+-ATPase活力突变菌的生长能力、葡萄糖代谢速率、乳酸产量和H~+-ATPase活性,并通过荧光定量PCR对编码H~+-ATPase的相关基因进行相对定量分析。结果表明,亲本菌ZUST、突变菌ZUST-1和ZUST-2在添加DCCD后菌体生长能力均减弱,葡萄糖代谢速率减慢,乳酸产量降低,H~+-ATPase酶活性也降低。由于受到发酵液中酸性环境以及外源抑制剂DCCD的胁迫,亲本菌ZUST和突变菌ZUST-2编码H~+-ATPase的所有基因在稳定期表达水平都高于对数期。与未添加DCCD相比,添加DCCD的亲本菌和突变菌ZUST-2在对数期H~+-ATPase各基因的表达水平均下调或基本不变,抑制了H~+-ATPase活力从而导致菌株的生长代谢速率减弱。此研究结果为进一步揭示植物乳杆菌中H~+-ATPase在酸胁迫下的调控机制奠定了基础。     

利用脯氨酸效应提高短乳杆菌谷氨酸脱羧酶的热稳定性

以磷酸吡哆醛为辅酶的谷氨酸脱羧酶(Glutamate decarboxylase,GAD),能专一、不可逆地催化L-谷氨酸脱去α-羧基生成γ-氨基丁酸。为了提高GAD热稳定性为目标,本研究通过与嗜热古细菌Thermococcus kodakarensis中GAD氨基酸序列的比对及引入脯氨酸策略,最终在短乳杆菌Lactobacillus brevis CGMCC No.1306的GAD突变体中筛选得到热稳定性提高的突变酶G364P。结果显示,突变酶G364P在55℃的半衰期以及半失活温度分别比野生酶提高19.4 min和5.3℃,并且突变酶G364P的催化效率与野生酶相比没有明显变化。此外,利用分子动力学模拟来验证突变对蛋白质热稳定性的影响,突变酶G364P的均方根偏差(Rootmeansquare deviation,RMSD)以及含G364的loop区域均方根涨落(Root mean square fluctuation,RMSF)均比野生酶低,引入脯氨酸增加了364位氨基酸与相邻氨基酸的疏水相互作用。文中通过引入脯氨酸成功提高了L. brevis中GAD的热稳定性,同时也为其他酶热稳定性的理性设计提供了方法学指导。     

删除Loop区域表面不稳定氨基酸提高 (R)-ω-转氨酶热稳定性

手性胺是一类具有重要价值的医药及精细化工中间体,如何实现手性胺类化合物的不对称合成是目前人们普遍关注的一个焦点问题。ω-转氨酶(ω-Transaminase,ω-TA)是一类能直接合成对映体手性胺的天然生物催化剂。相比于(S)-ω-TA,(R)-ω-TA的研究较少,但其需求量随着手性胺类药物的发展日趋增大。提高具有潜在应用价值的(R)-ω-TA的热稳定性,将有利于手性胺的制备。本文利用Py MOL软件和YASARA软件预测来源于土曲霉Aspergillus terreus的(R)-ω-TA中具有高温度因子(B-factor)的Loop区域,通过定点突变对Loop区域表面不稳定氨基酸逐步进行删除获得突变酶。结果表明,突变酶R131del和突变酶P132-E133del半失活温度分别为41.1℃和39.4℃,比野生酶提高了2.6℃和0.9℃;在40℃下的半衰期分别为15.0 min和10.0 min,为野生酶的2.2倍和1.5倍。此外,在400 K和10 ns的分子模拟条件下,突变酶R131del在Loop区域的均方根涨落(Root mean square fluctuation,RMSF)比野生型低,突变酶P132-E133del在Loop区域增加了4个氢键。本研究通过删除(R)-ω-转氨酶Loop区域表面不稳定氨基酸提高了该蛋白的热稳定性,同时也为其他酶热稳定性的理性设计提供了方法学指导。     

低H~+_-ATPase活性植物乳杆菌突变菌筛选及基因表达的相对定量分析

【目的】筛选H~+_-ATPase活性降低的植物乳杆菌突变菌,比较其与亲本菌基因表达水平的差异,进一步探索H~+_-ATPase的调控机制。【方法】利用硫酸新霉素诱变、筛选突变菌,并对亲本菌(ZUST)和突变菌(ZUST-1、ZUST-2)进行生长、产酸能力及H~+_-ATPase活性的测定。分别提取亲本菌和突变菌的基因组DNA,扩增H~+_-ATPase全部编码基因并测序。通过荧光定量PCR对H~+_-ATPase全部编码基因进行相对定量分析。【结果】突变菌的生长和产酸能力均低于亲本菌,突变菌ZUST-1和ZUST-2的H~+_-ATPase活性比亲本菌分别降低了10.1%和28.8%。突变菌ZUST-1和ZUST-2的atp A基因均有22个位点发生突变,而ZUST-2的atp C基因有6个位点发生突变。突变菌ZUST-1和ZUST-2的atp A在对数期基因表达水平分别比亲本菌ZUST下调了41.1%和35.7%,在稳定期分别下调了43.6%和14.2%;ZUST-1的atp C基因在对数期的表达水平比ZUST略高,在稳定期比ZUST上调了30%,而ZUST-2的atp C基因未表达。【结论】突变菌H~+_-ATPase活性减弱会导致其全部编码基因在稳定期表达水平上调(除ZUST-2的atp C不表达外),而且atp A和atp C基因突变导致的基因表达水平的差异是影响H~+_-ATPase活性的主要因素,此研究结果为进一步研究植物乳杆菌中H~+_-ATPase的调控机制奠定了基础。