重组人SOD1/3转基因山羊的制备及表达产物的检测

设计了以hSOD1、hSOD3为编码序列,以山羊β-酪蛋白/CMV杂合启动增强子构建乳腺特异性表达载体rhSOD1、rhSOD3,共转染母山羊胎儿成纤维细胞,采用PCR和扩增产物序列分析筛选获得SOD1/3克隆细胞株,应用体细胞核移植(SCNT)制备双转基因山羊。出生小羊经PCR和扩增产物序列分析验证是否成功整合外源基因,经Western blotting、ELISA及体外活性检来验证分析表达产物。结果表明:获得SOD1/3转基因山羊胎儿成纤维细胞系6株;原代双转基因体克隆山羊1只(♀);从该转基因羊乳汁中检测到rhSOD1、rhSOD3,浓度分别为:88.81±8.36 mg/L和267.82±12.67 mg/L;转基因羊乳汁中重组人SOD酶活性为1 432±157 U/mL。研究表明,以双载体和单标记基因转染山羊胎儿成纤维细胞可获得双基因整合转基因细胞系,并且以SOD1与SOD3功能基因均可在山羊乳腺中共同表达,表达产物具有较好的生物学活性。     

人乳铁蛋白 (hLF) 转基因山羊的遗传背景分析

以随机整合方式获得的转基因动物外源基因的拷贝数、整合位点及染色体核型等遗传背景并不清楚,可能会存在外源基因的沉默整合、无效整合、毒性整合以及其表达水平不可预测等问题。文中选取了6只原代(F0)及其相对应的子一代(F1)的人乳铁蛋白(hLF)转基因山羊作为研究对象,分别颈静脉采血、提取DNA,通过染色体核型分析、实时荧光定量PCR(qPCR)、ELISA和Westernblotting等检测技术,研究其外源基因的遗传背景与表达水平。结果显示,6只F0代转基因山羊的染色体没有明显的形态变异、数量改变等异常情况。相对拷贝数高低不同(2–16),且能够稳定地遗传给下一代,F0和F1代hLF基因拷贝数一致。F1代转基因山羊表达hLF水平最高可达1.12 g/L(L3-1,拷贝数8)。结果表明,整合的外源基因能够稳定地遗传下一代,也没有对转基因山羊个体的生长发育造成障碍,而且拷贝数高低与hLF表达水平无明显的相关性,这为转基因山羊及其他转基因动物的新品种培育奠定了基础,解析了遗传背景。     

提高动物乳腺生物反应器表达水平的策略

在转基因动物乳腺生物反应器研究中,组织特异性表达水平、表达率和表达定位性是决定性的指标。因此,高效表达乳腺生物反应器的制备是许多研究者要实现的目标,也是走向产业化的基本要求。本文从基因构件、动物基因转移方面叙述了如何提高乳腺生物反应器表达水平、增强表达特异性及表达率,着重探讨如何提高动物乳腺生物反应器表达水平。     

人工锌指核酸酶突变EGFP基因的功能分析

锌指核酸酶技术在基因定点修饰中具有效率高和特异性好等特点,并成功应用于数十种生物。目前,该技术是否能应用羊上尚未报道。为了敲除转基因山羊标记基因 (EGFP),构建了一对针对EGFP外显子上的锌指核酸酶表达载体,将其电转染至转EGFP基因胎儿成纤维细胞中,研究了锌指核酸酶突变EGFP基因的效率和方式,利用基因显微注射单细胞获得获得的转基因 (EGFP) 细胞系作为锌指核酸酶的靶细胞。结果显示,通过锌指核酸酶的突变作用,转染后的细胞发绿色荧光比例下降,测序结果显示在EGFP外显子中插入1个碱基G,导致编码EGFP基因的阅读框改变,从而起到基因突变的作用。结果表明,文中构建的锌指核酸酶对EGFP基因有突变作用,可以为以后获得无标记基因供核细胞进行体细胞核移植生产克隆羊奠定基础。     

转录激活因子样效应物核酸酶介导的山羊β-乳球蛋白基因敲除和人乳铁蛋白基因定点整合

为了敲除山羊乳中致敏源β-乳球蛋白(BLG)基因,同时在BLG基因座定点整合人乳铁蛋白(hLF)基因。首先针对山羊BLG第3外显子识别位点设计了1对特异性TALEN-3-L/R质粒对;同时,构建了含有1个HSV-TK负筛选基因的hLF基因打靶载体BLC14-TK。TALENs质粒对转染山羊胎儿成纤维细胞,2μg/m L嘌呤霉素筛选3 d,PCR扩增产物测序来验证其切割DNA活性。打靶载体BLC14-TK与TALEN-3-L/R质粒对共转染山羊胎儿成纤维细胞,经700μg/m L G418和2μg/m L GCV共筛选药物抗性细胞株;通过整合检测和同源重组检测来筛选hLF基因打靶细胞株;BLG~–/hLF~+打靶细胞株作为供核细胞进行山羊体细胞核移植。结果为:TALEN-3-L/R致突变率为25%-30%;获得BLG~–/hLF~+打靶细胞6株;共制作重构胚胎335枚,移植受体山羊23只,B超检测到30-35 d的妊娠受体9只(妊娠率39.1%),其中1只50日龄克隆胎儿验证为BLG~–/hLF~+基因型。以上结果表明获得BLG基因座定点整合hLF基因的基因打靶山羊是可行的,为培育羊乳中含低致敏原和富含hLF的山羊新品系奠定了基础。     

突变靶基因xylE转基因小鼠

本研究以ｐＥＳｎｘ穿梭质粒为载体,选用恶臭假单孢杆菌ＴＯＬ质粒上的ｘｙｌＥ基因作为突变靶基因组构建的重组构件,经微注射导入ＩＣＲ小鼠５４９枚受精卵雄原核,将存活的３５２枚卵移入２４只假孕鼠输卵管内,７只妊娠,共产仔４１只,其中７只死胎,出生后死亡４只,３０只存活。注射卵存活率为６４％（３５２／５４９）,出生率为１１．６％（４１／３５２）。存活鼠经ＰＣＲ－Ｓｏｕｔｈｅｒｎ检测,整合率为５７％（１７／３０）。在整合阳性鼠中选择了杂交信号较强的２只当代公鼠,通过回收载体和转化试验,结果表明整合基因完整,具有转化的功能,由此,建立了突变靶基因ｘｙｌＥ转基因小鼠模型。     

通过染色体外同源重组建立乳腺中表达外源基因的转基因小鼠

为研究染色体外重组方法在创建转基因动物中的应用,选取牛asl酪蛋白基因的5′及3′侧翼区和氯霉素乙酰化酶编码区,构建了两个具有3 kb相互重叠的融合基因.将这两个DNA片段末端脱磷酸后,以摩尔比1:1的比例混合,通过显微注射导入小鼠受精原核,最后获得了11个品系的转基因小鼠.对其中10个品系的小鼠的整合分析表明,所注射的两个DNA片段均发生了染色体外同源重组,而且除了 1个品系的小鼠丢失了大约1kb的序列外,其余品系小鼠的重组产物与预想的结构符合.在当代和后代的转基因小鼠乳汁中均可测到氯霉素乙酰化酶的活性.这表明融合基因在转基因小鼠乳腺中得到表达和分泌,也说明显微共注射两个相互重叠的基因片段是建立转基因动物的一个可行途径.     

鼠脑突触体Mg^2＋—ATP酶质子泵活性的研究

位于突触体质膜的外向型（ｅｃｔｏ）Ｍｇ＾２－ＡＴＰ酶具有水解ＡＴＰ活性,能量偶联的ＡＣ－ＭＡ荧光淬灭实验表明Ｍｇ＾２＋－ＡＴＰ酶水解ＡＴＰ时向膜内转移质子,建立跨膜质子梯度,跨膜质子梯度可以被电中性Ｋ＾＋／Ｈ＾＋离子载体Ｎｉｇｅｒｉｃｉｎ消除,利用Ｈ＾＋敏感的ＢＣＥＣＦ荧光分子测定突触的ｐＨｉ变化,结果表明水解ＡＴＰ产生的质子转移突触体ｐＨｉ下降了光分子测定突触的ｐＨｉ变化,结果表示水解ＡＴＰ产生     

Transient expression of hepatitis B virus surface antigen (HBsAg) and human erythropoietin (hEPO) genes in milk after direct introduction into ewe

Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｍｉｌｋｐｒｏｔｅｉｎｇｅｎｅｓｉｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎａｈｕｇｅｎｅｔｗｏｒｋｏｆｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｃｉｒｃｕｉｔｓｗｈｉｃｈａｒｅｌｉｎｋｅｄｔｏｔｈｅｉｎｔａｃｔｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇｍａｍｍａｒｙｇｌａｎｄ,ａｎｄｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓｄｕｒｉｎｇｐｕｂｅｒｔｙ,ｐｒｅｇｎａｎｃｙ,ｌａｃｔａｔｉｏｎａｎｄｉｎｖｏｌｕｔｉｏｎ.Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐｕｔａｔｉｖｅｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｅｌｅｍｅｎｔｓａｎｄｈｙｂｒｉｄｇｅｎｅｉｎｔｉｓｓｕｅｃｕｌｔｕｒｅｓｙｓｔｅｍｓ…     

质体醌重组的D1／D2／Cytb559复合物的荧光衰减动力学和光破坏作用

光系统Ⅱ反应中心Ｄ１／Ｄ２／Ｃｙｔｂ５５９ 在分离纯化过程中失去了电子受体ＱＡ 和ＱＢ,人工合成的质体醌可以与Ｄ１／Ｄ２／Ｃｙｔｂ５５９ 复合物发生重组。癸基质体醌（ＤＰＱ）与Ｄ１／Ｄ２／Ｃｙｔｂ５９９ 复合物的重组导致该复合物的荧光强度下降及发射光谱蓝移,同时两个与光化学活性相关的长寿命（２４ ｎｓ和７３ ｎｓ）荧光衰减组分占整个荧光的百分数下降,这些结果表明ＤＰＱ作为Ｐｈｅｏ－ 的电子受体,限制了Ｐ６８０＋ ·Ｐｈｅｏ－ 的电荷重组。ＤＰＱ 的加入对Ｄ１／Ｄ２／Ｃｙｔｂ５５９复合物中Ｃｈｌａ 分子的光破坏敏感性影响不大,但β－胡萝卜素在加入ＤＰＱ 之后可以被光照破坏,这个过程可能与β－胡萝卜素的生理功能相关。