麻疯树Jc-Tctp1基因的同源性分析及时空表达模式鉴定

从麻疯树胚乳cDNA文库中获得了翻译调节肿瘤蛋白(translationally controlled tumor protein,TCTP)cDNA 序列,命名为 Jc-Tctp 1 (GenBank 登录号为EF091818).该序列全长1410 bp,开放阅读框由507个碱基组成.Jc-Tctp 1 编码的推测蛋白产物含有168个氨基酸残基,该蛋白具有典型的TCTP蛋白特点:由3个α螺旋组成α螺旋核心、4个β片层结构构成β片层核心,及微管结合结构域(MTB)和钙结合结构域(CaB).其推测氨基酸序列与巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)、油棕(Elaeis guineensis)、大豆(Glycine max)、水稻(Oryza sativa,japonica cultivar-group)、黑杨(Populus trichocarpa)、番茄(Lycopersicon esculentum)、西加云杉(Picea sitchensis)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)以及玉米(Zea may)的TCTP同源性依次为93%、90%、85%、84%、85%、84%、77%、80%和77%.经构建含Jc-TCTP1在内的植物TCTP蛋白分子进化树分析,发现单子叶植物并未按照其生物学分类的地位出现聚合.用半定量RT-PCR研究Jc-Tctp1 基因的表达模式,结果显示,其表达在转录水平上具有一定的组织和时间特异性,茎、I期胚乳、胚中最为丰富,而在Ⅱ期胚乳和花中表达最弱.     

麻疯树核糖体失活蛋白基因的克隆和表达

麻疯树(Jatropha curcas L.)核糖体失活蛋白(curcin)是存在于麻疯树种子中的一种毒性较强的蛋白,它与蓖麻毒蛋白和相思子毒蛋白的性质相似,属Ⅰ型核糖体失活蛋白。从麻疯树种子中分离得到一种分子量为28.2kD的蛋白质,其对无细胞系统中蛋白质合成的抑制活性较强,IC_(50)为(0.19±0.01)nmol/L,具有RNA N-糖苷酶活性。依据curcin的N端部分氨基酸设计简并引物,通过RT-PCR和5′-RACE技术从未成熟种子总RNA中克隆到curcin全长cDNA序列。该cDNA全长由1 173个碱基组成,包含一个编码293个氨基酸的前体蛋白,前42个氨基酸为信号肽。推测的多肽序列与测定的蛋白质N端序列相同,与多种已发表的Ⅰ型核糖体失活蛋白和Ⅱ型核糖体失活蛋白的A链有一定的同源性。将curcin的编码区与表达载体pQE-30相连后,转入大肠杆菌(Escherichia coil)M15菌株中得到了有效的表达。将表达的融合蛋白纯化后发现,它具有抑制无细胞系统蛋白质合成的能力。     

麻疯树G蛋白γ亚基JcAGG3基因的克隆及表达分析

从麻疯树c DNA中克隆到一个与拟南芥AGG3同源的基因,命名为Jc AGG3。该基因开放阅读框为834bp,编码277个氨基酸,软件预测等电点为8.61,分子质量为30.514k Da。亚细胞定位预测显示其定位于细胞质膜上。在该基因的顺势作用元件上发现了与胚乳发育、激素调节、光响应和逆境胁迫相关的启动元件。荧光定量PCR(q PCR)检测发现,Jc AGG3在根、茎、叶和种子中均有表达,在发育中的种子中表达量最高,幼叶中的表达量显著高于老叶,在茎中只检测到极微量的表达;对麻疯树的幼苗进行黑暗处理后Jc AGG3基因表达显著下调,脱落酸(ABA)和干旱胁迫处理下Jc AGG3表达量显著增加。     

麻疯树苯丙氨酸解氨酶启动子的克隆和表达载体的构建

苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia lyase, PAL）是苯丙烷类代谢途径的关键酶,催化苯丙氨酸转化为肉桂酸,促进黄酮、香豆素等次生代谢物的生成。本文根据已克隆的麻疯树苯丙氨酸解氨酶基因JcPAL的序列设计引物,通过DNA步移技术,克隆出长度为1 334 bp的JcPAL基因起始密码子上游序列。序列分析显示其不仅具备CAAT、TATA盒这些保守元件,而且包含多种胁迫诱导元件,特别是在序列中发现一些苯丙氨酸解氨酶特有的元件。为了鉴定JcPAL基因的启动子元件,分别将长度不同的5′端侧翼区缺失体定向插入载体pBI121中, 取代原有的CaMV35S启动子,构建了4个驱动报告基因GUS的植物表达载体。     

IaaL基因的维管束特异表达导致烟草茎和根外植体分化能力的改变

我们利用水稻苯丙氨酸解氨酶启动子(AQ630)和吲哚乙酰胺赖氨酸酯合成酶基因(iaaL)构建了维管束特异表达的植物表达载体pBAL1并导入烟草基因组中。比较了对照植株、转基因植株的幼茎和根外植体在组织培养中分化能力的变化,结果表明转基因植株茎外植体的不定芽形成明显受到促进,而转化植株根外植体在不定根发生方面对外源IAA的敏感性下降。     

植物菌根块菌分子鉴定及菌丝培养基优化的研究

块菌属(Tuber)是由真菌感染其适宜植物根系形成,部分块菌如法国黑孢块菌(T. melanosporum)和中国印度块菌(T. indicum)等为珍稀药食两用菌,具有很高的经济价值。对块菌的过度挖掘造成野生块菌资源匮乏,块菌人工栽培技术则是实现块菌产业可持续性发展的重要基础。目前国内外人工栽培主要采用块菌子实体匀浆制成的子囊孢子悬浮液,与人工种植苗木根系共生。利用块菌菌丝替代子实体孢子悬浮液进行接种,具有减少对块菌子实体的依赖性和生产成本、保护林下块菌野生资源、促进块菌人工繁育进程的积极意义,但需要成熟高效的菌丝培养技术。该研究从云南、陕西等地林下采取块菌样品,在ITS分子鉴定并纯化得到纯种菌丝的基础上,以菌丝直径为指标,经单因素实验和4因素3水平正交实验L9(34),筛选得出最适宜的菌丝生长培养基。结果表明:(1)形态和ITS分子鉴定得到的13份块菌样品分属印度块菌(T. indicum)和假凹陷块菌(T. pseudoexcavatum)两种。(2)纯化的印度块菌菌丝培养基的最佳碳源为马铃薯浸出液,最佳氮源为酵母膏,VB1对印度块菌菌丝生长并无显著性促进作用。(3)最佳的碳源、氮源、无机盐组合为马铃薯浸出液150 g·L~(-1)、酵母膏3 g·L~(-1)、MgSO_42 g·L~(-1)、KH2PO42 g·L~(-1)。25℃,自然pH下培养8 d菌丝直径可达49.44 mm。     

麻疯树Jc-Tctp1基因的同源性分析及时空表达模式鉴定

从麻疯树胚乳cDNA文库中获得了翻译调节肿瘤蛋白（translationally controlled tumor protein, TCTP）cDNA序列，命名为Jc-Tctp1（GenBank登录号为EF091818）.该序列全长1 410 bp，开放阅读框由507个碱基组成.Jc-Tctp1编码的推测蛋白产物含有168个氨基酸残基，该蛋白具有典型的TCTP蛋白特点：由3个α螺旋组成α螺旋核心、4个β片层结构构成β片层核心，及微管结合结构域（MTB）和钙结合结构域（CaB）.其推测氨基酸序列与巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）、油棕（Elaeis guineensis）、大豆（Glycine max）、水稻（Oryza sativa,japonica cultivar-group）、黑杨（Populus trichocarpa）、番茄（Lycopersicon esculentum）、西加云杉（Picea sitchensis）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）以及玉米（Zea may）的TCTP同源性依次为93 %、90 %、85 %、84 %、85 %、84 %、77 %、80 %和77 %.经构建含Jc-TCTP1在内的植物TCTP蛋白分子进化树分析，发现单子叶植物并未按照其生物学分类的地位出现聚合.用半定量RT-PCR研究Jc-Tctp1基因的表达模式，结果显示,其表达在转录水平上具有一定的组织和时间特异性，茎、Ⅰ期胚乳、胚中最为丰富，而在Ⅱ期胚乳和花中表达最弱.     

麻疯树毒蛋白curcin2基因的两个原核表达载体的构建和表达

从麻疯树基因组中扩增到毒蛋白curcin2基因成熟肽编码区,成功构建了原核表达载体pET-C和pQE-C,并转化大肠杆菌获得转化子PCB和PCM。在不同温度、不同浓度IPTG和不同诱导时间下,PCB都没有curcin2重组蛋白产生,而PCM能表达出curcin2,主要以包涵体形式存在。诱导温度较低时,延长诱导时间有可溶性的curcin2产生。在文章的实验中,PCM表达curcin2的优化条件为:温度16℃,IPTG1mmol·L-1,时间16￣24h。     

川草 2 号老芒麦 (Elymus sibiricus L.) atpA 基因的克隆及其调控表达

ATPase 与植物的耐寒性密切相关 . 运用 mRNA 差异显示技术 (DDRT-PCR) 从耐寒植物川草 2 号老芒麦 (Elymus sibiricus L. cv. ‘ chuancao No.2 ' ) 中获得了受冷抑制的 atpA 基因表达序列标签 (EST) 序列,通过 5 ′ cDNA 末端快速扩增 (RACE) 获得了 atpA 基因全长 cDNA 为 1 754 bp ,开放阅读框 (ORF) 长 1 518 bp ,编码 505 个氨基酸 . 氨基酸序列与小麦、水稻、玉米 atpA 基因分别具有 95 ％、 94 ％、 94 ％的相似性 . 对 2 ℃低温胁迫及解除胁迫后恢复过程中共 13 个时段的 RNA 印迹分析表明, atpA 基因在低温胁迫 12 h 转录受到强烈抑制,在低温胁迫开始后的 4 ～ 8 h 及解除胁迫后的 16 ～ 24 h ,其转录水平明显强于对照 . 实验结果为揭示 CF₁α亚基对调控 ATPase 在植物御冷性反应的作用,以及α亚基在植物低温信号转导中的作用提供了新的线索 .