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1.
2.
 本文建立了组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)活力的发光固相测定方法。用氨基乙基丁基异鲁米诺(ABEI)标记纤维蛋白原(Fg),在一定条件下,t-PA作用于固相(包被ABEI-Fg),产生纤维蛋白的降解产物。测定可溶性降解产物的发光强度,即能计算t-PA活性。该方法的标准曲线范围对t-PA为0.156IU/mL~40IU/mL。灵敏度可达0.156IU/mL。回收率为98.6%(n=27)。批内批间变异系数分别为6.6%及10.3%。该方法曾用于检测细胞培养液中提取t-PA样品及t-PA基因表达时培养液中t-PA的活性。也曾用于检测从组织中纯化t-PA样品及血浆中t-PA活性的测定。文中讨论了该方法与其它方法优缺点的比较。  相似文献   
3.
t-PA cDNA在CHO细胞中的高效稳定表达   总被引:1,自引:0,他引:1  
我们曾报道t-PA mRNA非翻译区序列对其表达有明显的抑制作用,在此基础上,通过对5′-UTR及3′-UTR的改造,使t-PA在COS-7细胞中的表达水平提高30倍左右。将t-PA表达质粒用电击法转染中国仓鼠卵巢细胞二氢叶酸还原酶缺陷株(CHO-dhfr),经过混合加压及筛选,在CHO细胞中高效表达了t-PA,表达水平达到5000~6000 IU/10~6细胞/24hr。重组t-PA具有与天然t-PA相同的分子量及酶活性。经过8个月连续传代,表达水平未下降,表明细胞株是稳定的,其主要指标均符合工程细胞株的要求。  相似文献   
4.
陈琳  徐秀英 《生物技术》1998,8(2):16-18
组织型纤溶酶原激活剂(t—PA)溶栓特异性高,但半衰期短。本组构建了增强纤维蛋白亲合力和延长半衰期的t—PA突变体表达细胞株。测定工程细胞株基因拷贝数是细胞生物学特性鉴定的一个方面。我们采用狭缝杂交法和SouthernBlot法对该细胞株t—PA基因进行了拷贝数测定,结果为30—60个拷贝。  相似文献   
5.
构建了EPO真核表达质粒,成功地实现了其在CHOdhfr-细胞中的表达,所得到的EPO工程细胞株的形态与CHOdhfr-细胞相似,细胞株小瓶静止培养时最高表达水平为2~3μg/106cells/24h,而且细胞表达稳定,连续传代三个月和反复冻存复苏三次,细胞表达水平无明显下降。经过对细胞的一系列特性分析表明,该细胞株无支原体、真菌及细菌污染,无致瘤性,形态正常,染色体畸变率与出发株相当。  相似文献   
6.
为获纯度较高的t-PA抗原,对本组构建的表达t-PA的CHO工程细胞的无血清培养上清进行SDS-PAGE,铜染色,从中提纯少量抗原t-PA,获得高纯度的产物,蛋白回收率达88%。中和抑制实验表明,回收的目的蛋白能完全被t-PA抗血清所抑制。  相似文献   
7.
t-PA突变体工程细胞株FSGGI48形态与其亲代细胞CHO-dhfr相似呈多角形,类似上皮细胞。在MTX加压至5×10~(-6)mol/L时,少数细胞形态略变瘦长,但仍呈多角形,因此该工程细胞株形态正常。抗体中和抑制试验及纤维蛋白板80℃加热试验显示,FSGGI48细胞表达产物与st-PA的活性均能被抗t-PA抗体所抑制,而胰酶的活性则不被抑制,且二者在80℃加热的纤维蛋白板上均不产生溶解圈,胰酶则产生溶解圈,由此可知,该细胞株表达产物为特异的rt-PA产品。细胞无血清培养上清经FA-PA检测,亚克隆株表达水平为4000IU/10~6细胞/24h。分别测定冻存3个月后复苏和体外传代3个月以上细胞的表达水平,结果显示部分亚克隆细胞株表达水平下降,多数仍为3000-4000IU/10~6细胞/24h,说明细胞株稳定性好。裸鼠试验表明,该工程株活细胞、细胞DNA、纯化的细胞表达产物均无致瘤性。支原体检查结果为阴性。染色体分析显示,FSGGI48细胞与其亲代细胞(CHO-dhfr细胞)染色体数目相同均为20条,但均有不同程度不同类型的畸变。CHO-dhfr细胞畸变率为6%。该工程细胞的畸变率为15%-18%,在允许范围内。结果证明,t-PA突变体细胞株FSGGI48为性能优良的工程细胞株。  相似文献   
8.
为了获得半衰期延长,特异活性提高及具有PAL-1抗性的新型t-PA溶栓剂,利用基因重组及定位突变技术构建了t-PA的K1、K2区糖基化位点消除,PAI-1结合位点缺失,F与E区连接序列His44~Ser50置换为纤粘蛋白Ⅰ型F区间连接序列GluSerLysProGluAlaGluGlu的t-PA组合突变体FrGGI,并在中国仓鼠卵巢细胞中获得了高效表达。对表达产物的生物学特性分析表明,FrGGI在大鼠血浆中的半衰期延长了15倍,并获得了PAI-1抗性,是一株很有希望的新型溶栓剂候选株。  相似文献   
9.
体内存在两种纤溶酶原激活剂(plasminogen activator, PA):血液中生理性的组织型纤溶酶原激活剂(t PA)及尿中的尿激酶型纤溶酶原激活剂(u PA)。它们通过将纤溶酶原转变成有活性的纤溶酶而启动纤溶过程使血栓溶解。目前模拟体内纤溶过程以纤维蛋白为底物的PA物质活性测定方法有纤维蛋白溶圈法和发光分析法,但这两种方法不能  相似文献   
10.
人红细胞生成素(EPO)工程细胞建立及特性分析   总被引:5,自引:0,他引:5  
构建了EPO真核表达质粒,成功地实现了其在CHO-dhfr^-细胞中的表达,所得到的EPO工程的细胞株的形态与CHO-dhfr^-细胞相似,细胞株小瓶静止培养时最高表达水平为2-3μg/10^6cells/24铺达稳定,连续传代三个月和反复冻存复苏三次,细胞表达水平无明显下降。经过对细胞的一系列特性分析表明,该细胞株无支原体、真菌及细菌污染、无致瘤性,形态正常,染色体畸变率与出发株相当。  相似文献   
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