心脏形成关键基因-TBX5在大鼠胚胎心脏中的克隆及表达研究

为了研究心脏形成关键基因-TBX5的表达情况,选择Wistar大鼠作为从分子水平研究心脏发育的实验动物并从胎鼠心脏中克隆了TBX5cDNA全长（GenBank登录号：AY859491）,其cDNA及氨基酸序列不同于GenBank预测序列;随后应用RT-PCR及Northem blot分析TBX5基因在大鼠各组织中的表达情况,发现TBX5为单一转录本,在大鼠各组织均有表达,心脏中表达最强;构建荧光表达载体,转染大鼠肝癌细胞,观察TBX5亚细胞定位,结果证实TBX5基因在细胞核中表达;最后构建原核表达载体,IPTG诱导表达获得了GST-TBX5融合蛋白。以上工作为进一步鉴定心脏发育中TBX5相关转录因子及研究相互间的调控机制奠定了基础。     

单纯性先天性心脏病中TBX5基因表达异常的机制

为探讨人类单纯性先天性心脏病患者中TBX5基因表达下调的可能原因, 应用变性高效液相色谱(DHPLC)方法检测100例单纯性先天性心脏病患者中TBX5基因上游1 200 bp调控区的突变情况; 应用甲基化敏感性限制性内切酶(MS-RE)法检测50例单纯性先天性心脏病患者和5例非先天性心脏病患者心肌组织TBX5基因启动子区两个CpG岛(转录起始点上游-49~-188 bp和-247~-464 bp处)的甲基化情况; 应用P-match软件预测小鼠Tbx5基因上游转录因子Nkx2-5的结合位点, 构建Nkx2-5表达载体转染小鼠H9C2(2-1)心肌细胞, RT-PCR及Western blotting检测Tbx5基因表达, 凝胶阻滞实验(EMSA)验证Nkx2-5和Tbx5基因的作用。结果在100例单纯性先天性心脏病患者中, 未检测到TBX5基因上游1 200 bp调控区突变; 非先天性心脏病患者和单纯性先天性心脏病患者在两个CpG岛存在相同的甲基化; 小鼠Tbx5基因转录起始点上游-312~-315 bp可能存在Nkx2-5的结合位点, 转染Nkx2-5表达载体后Tbx5基因在mRNA及蛋白质水平均有表达增高趋势, Nkx2-5在体外可以与Tbx5基因上游-312~-315 bp序列相结合。以上结果提示TBX5基因调控区突变和两个CpG岛的甲基化不是单纯性先天性心脏病患者心肌组织中TBX5基因表达下调的原因, TBX5基因表达下调可能由于NKX2-5的表达异常引起。