宠物重要人兽共患寄生虫病

随着宠物饲养的盛行,与宠物相关的人兽共患寄生虫病愈加得到高度重视。为了避免和减少人兽共患寄生虫病的流行,本文就几种重要的宠物人兽共患寄生虫病的流行情况、诊断及防治等作一介绍,以期提高认识,防患未然。     

刚地弓形虫亲环蛋白基因TgCyP真核表达质粒的构建及其在Hela细胞内的表达

亲环蛋白(cyclophilin,CyP)是一类广泛存在于原核和真核生物体内的胞溶性蛋白,是刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)速殖子的主要成分,能够诱导产生IL-12和IFN-γ,在控制弓形虫急性感染过程中起重要作用.本研究根据GenBank发表的TgCyP基因序列,设计并合成一对包含BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点的引物,以cDNA为模板,应用PCR技术扩增TgCyP基因.PCR产物连接到pMD18-T克隆载体.用限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切克隆载体,将TgCyP目的基因克隆到载体pVAX1,构建真核表达质粒pVAX1-TgCyP.将真核表达质粒转染Hela细胞,利用间接免疫荧光检测其在Hela细胞内的表达情况.结果表明扩增的TgCyP基因与GenBank上相应基因序列(U04633.1)的一致性达100%,构建的真核表达质粒pVAX1-TgCyP能在转染的Hela细胞中表达,其表达产物与刚地弓形虫阳性血清具有免疫反应性.本研究表明TgCyP有望作为弓形虫疫苗的候选抗原,将为进一步研究该质粒的动物免疫试验奠定基础.     

EGFP标记柔嫩艾美耳球虫重组卡介苗的构建及其在鸡体内的分布

鸡球虫病给禽类养殖业带来重大经济影响。本实验利用DNA重组技术将柔嫩艾美尔球虫保护性抗原基因rhomboid和增强型绿色荧光蛋白EGFP基因串连，将其克隆到BCG中，构建EGFP标记柔嫩艾美耳球虫重组卡介苗pMV361-Rho／EGFP。将rBCG口服免疫6日龄雏鸡，一周后剖杀，取肝、脾、肺、肾、盲肠各组织器官制作冰冻切片，激光共聚焦显微镜观察各组织器官rhomboid表达情况。另分别于免疫后7，14，21，28天提取肝、脾、肺、肾、盲肠各组织器官总RNA，实时定量RT-PCR方法检测rhomboid目的基因转录情况，比较各时期组织器官rhomboid基因表达量。结果显示，免疫一周后，用激光共聚焦显微镜观察到在肝、脾、肺、肾、盲肠各组织器官中均有EGFP表达。实时定量RT-PCR结果显示，免疫14天后rhomboid基因表达量达到高峰，随后开始下降，至28天后消失。本研究为重组卡介苗疫苗作为抗球虫疫苗的研究奠定基础。     

SMG1-UPF1-eRF1-eRF3复合体参与贾第虫无义介导的mRNA降解激活

无义介导的mRNA降解（NMD）是一种重要的真核生物mRNA质量监控途径。NMD可识别并降解含有提前终止密码子（PTC）的异常mRNA（PTC-mRNA）。但NMD途径对PTC-mRNA的识别和降解机制尚无阐明。蓝氏贾第虫（Giardia lamblia）是一种寄生性的原生动物,进化上处于真核生物基部,对其NMD途径的研究有利于了解NMD途径的机制与进化。本研究通过双分子荧光互补实验、酵母双杂交实验和体外pull-down实验,分析了贾第虫的UPF1 (GlUPF1)、SMG1 (GlSMG1)和肽链释放因子（GleRF1、GleRF3）之间的相互作用关系。结果表明,贾第虫的肽链释放因子都能够与GlUPF1发生相互作用,且GlUPF1的CH结构域与GleRF3能够形成较稳定的复合体,而GlSMG1的激酶结构域PIKK能与UPF1的C端和N端结构域相互作用。进一步研究证实,GlSMG1的PIKK结构域能使GlUPF1两种截短体GlUPF1（1~500 aa）和GlUPF1（501~1 304 aa）发生磷酸化修饰,说明GlUPF1 的N端和C端均有GlSMG1的磷酸化位点。进一步分析证实,T111是GlUPF1上的1个磷酸化位点。我们的研究结果表明,贾第虫NMD途径起始阶段,首先在mRNA的PTC处的核糖体上形成SMG1-UPF1-eRF1-eRF3(SURF)复合体,并且GlSMG1磷酸化修饰GlUPF1,由此激活NMD途径,可能招募XRN1和SKI7d等酶参与无义mRNA的降解。     

柔嫩艾美耳球虫重组鸡痘病毒的构建与免疫保护研究

以鸡柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)杂交株F2的RNA为模板,应用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术扩增了杂交株F2的Rhomboid蛋白家族相关基因,将PCR产物克隆至pMD18-T载体中,构建出克隆质粒pMD-Rhomboid.以KpnⅠ、PstⅠ双酶切重组质粒pMD-Rhomboid和鸡痘病毒载体质粒pUTA2,并将纯化的Rhomboid基因亚克隆至鸡痘病毒载体pUTA2复合启动子下游,构建出真核表达重组质粒pUTA-Rhomboid.采用脂质体转染技术,将该质粒转染FPV282E4株感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)中,通过BrdU药物加压筛选,并通过RT-PCR和蛋白质印迹等方法检测,筛选出一株球虫鸡痘重组病毒rFPV-Rhomboid.进一步经CEF扩增病毒后,免疫雏鸡,监测免疫指标.结果表明:重组病毒接种鸡外周血中的CD4 、CD8 含量显著高于非免疫对照组(P<0.05);与对照组相比,重组病毒对鸡的增重效果差异显著(P<0.05),对E.tenella的攻击具有一定的保护作用,显示出较好的应用前景.