HIV-1 tat基因改造及其蛋白表达、纯化与抗体制备

目的:为了方便实验室工作中HIV-1B'/C亚型及C亚型Tat蛋白的检测,制备了相应的Tat蛋白及其抗体。方法:将我国HIV-1B'/C亚型流行株tat基因的第1个外显子和HIV-1C亚型tat基因的第2个外显子融合在一起,将密码子替换为大肠杆菌的优势密码子,通过合成引物、PCR拼接的方法,获得目的基因序列;在原核系统中与pET32a 载体中的His·Tag、Trx·Tag及S·Tag进行融合表达;目的蛋白经Ni 金属螯合层析柱纯化后,用于免疫家兔,制备多克隆抗体。结果:PCR拼接获得306bp的目的基因序列;在原核系统中融合表达得到相对分子质量约31000的融合蛋白,占菌体总蛋白的21%。纯化后的融合蛋白免疫家兔,制备了多克隆抗体,Western印迹结果显示,获得的多克隆抗体与HIV-1B'/C亚型的Tat蛋白反应良好;间接免疫荧光结果表明,获得的多克隆抗体与HIV-1B'/C亚型和C亚型的Tat蛋白都能产生特异性反应。结论:制备的多克隆抗体能够使用间接免疫荧光方法检测HIV-1C亚型的Tat蛋白,使用Western印迹方法和间接免疫荧光方法都能检测HIV-1B'/C亚型的Tat蛋白。     

非复制重组痘苗病毒表达人免疫缺陷病毒Bostwana C亚型Nef蛋白及免疫效果的观察

从含人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)Bostwana C亚型全基因的质粒pJM4-HIV中克隆了nef基因,并利用非复制型痘苗病毒载体构建表达Nef蛋白的重组病毒NTVJ1175nef,经PCR和Southern blot鉴定,nef基因正确整合到痘苗病毒基因组的J片段上;感染人源细胞后,经Western blot和免疫荧光检测表明,重组病毒能很好地表达Nef蛋白,并定位于细胞质中.NTVJ1175nef免疫BALB/c小鼠后,经Pep-IFN-'γ-Assay法检测,可诱导产生针对表位肽P1特异的可分泌IFN-'γ的C 8 T细胞(占脾细胞总数0.20%);经乳酸脱氮酶(LDH)法检测证实,诱导的细胞毒性T细胞(CTL)可特异性地杀伤表位肽P1特异P815靶细胞.这些结果表明,NTVJ1175nef具有良好的细胞免疫原性,为下一步构建表达包含HIV早期抗原的多组分重组痘苗病毒候选疫苗奠定了免疫学基础.     

表达乙型脑炎病毒抗原的非复制型重组痘苗病毒能在小鼠中诱发免疫保护

使用2×107PFU乙脑病毒野毒株GSS抗原preM-E-NS1-NS2a的非复制型重组痘苗病毒NTV-JEV免疫3周龄BALB/c小鼠,小鼠体内乙脑病毒特异性抗体滴度1∶71,IgG2a/IgG1为1.5,中和抗体滴度为1∶8,免疫组小鼠产生特异性补体介导的细胞杀伤作用。以10 LD50乙脑P3株病毒对小鼠进行了脑内攻击,NTV-JEV免疫组小鼠存活率为100%,与乙脑减毒活疫苗SA14-14-2免疫组存活率相同。100 LD50P3株病毒攻击后NTV-JEV免疫组存活率28.6%,与SA14-14-2组免疫效果无明显差别。存活小鼠体内乙脑病毒特异性抗体升高为1∶179,IgG2a/IgG1比值为1.9,中和抗体大于1∶16。以30 LD50GSS株病毒进行攻击后,NTV-JEV免疫组和SA14-14-2组保护率均为8.3%。上述结果表明,NTV-JEV与乙脑减毒活疫苗SA14-14-2株具有相近的保护力,NTV-JEV不仅可以保护小鼠抵抗同株病毒GSS的攻击,而且可以抵抗异株病毒P3的攻击。     

SARS-CoV假病毒中和试验技术的建立及评价

为避免传统的SARS病毒中和试验需要操作活毒而存在的生物安全隐患,建立了基于假病毒系统、操作较安全的SARS中和试验技术平台。本研究应用高效表达SARS-CoV S(密码子优化的全长S蛋白,简称S)的真核表达载体(pVRC8304),与HIV慢病毒包装质粒(p CMV△8.2)及转移质粒(pHR′CMV EGFP)3个质粒载体系统共同转染人胚肾细胞293T,包装了SARS假病毒;通过SARS假病毒感染的RD-A细胞中标记基因EGFP表达的分析,确定SARS假病毒能有效进入细胞,建立了可在BSL-2级实验室操作的SARS病毒中和试验技术平台。用该技术平台对不同免疫血清进行了中和抗体分析,并比较了基于假病毒和基于SARS活病毒的中和试验效果。结果显示:SARS假病毒和SARS活病毒两个中和试验系统获得中和抗体滴度变化趋势一致,表明本研究构建的SARS假病毒可替代SARS活病毒用于建立操作上安全的SARS病毒中和试验技术平台。     

表达绿色荧光蛋白的重组痘苗病毒的初步应用

目的:制备表达绿色荧光蛋白的重组痘苗病毒,并初步探讨其应用。方法:构建制备表达绿色荧光蛋白的重组痘苗病毒RVJ11LacZ-I1LGFP;分别利用药物昔多福韦与抗痘苗病毒高效价免疫血清,建立基于该病毒的荧光生成抑制实验及荧光减数中和实验。结果:荧光生成抑制实验与传统的噬斑生成抑制实验相比,结果一致,但判读更直接快速;重组痘苗病毒RVJ11LacZ-I1LGFP亦可用于体外快速高通量评价正痘病毒疫苗的中和能力。结论:利用表达绿色荧光蛋白的重组痘苗病毒建立了直接简便快速高通量的抗痘病毒药物筛选及体外中和评价技术。     

按痘苗病毒优势密码子改造HIV-1 gag基因提高表达水平的研究

为确定痘苗病毒密码子偏向性与基因表达的关系及其在痘苗病毒与宿主细胞相互作用过程中的作用,按痘苗病毒的优势密码子对HIV-1 gag基因进行改造,并对合成基因与野生型HIV-1 gag基因在痘苗病毒载体系统的表达水平进行了研究。结果显示：①各目的基因分别正向插入了痘苗病毒TK区7．5k启动子下游;②免疫荧光检测显示,改造前后的gag基因均能够很好地在痘苗病毒中表达;③Western blot检测显示,在相同感染量时,改造后的gag基因具有更高的表达水平;④流式细胞术检测显示,密码子改造后的gag基因较野生型gag基因表达水平提高约17％。上述结果表明：按照痘苗病毒优势密码子进行外源基因改造,可作为提高外源基因在痘苗病毒中表达的策略,同时提示,密码子偏向性是痘苗病毒与宿主细胞相互作用的重要调控因素。     

表达HIV-1六种基因的非复制型重组痘苗病毒在CEF细胞中遗传稳定

本研究目的是了解表达HIV-1六种基因的非复制型重组痘苗病毒(rNTV-C)的遗传稳定性(包括病毒载体和六种外源基因:gp160、gag、polr、evt、at和nef)。我们将rNTV-C在原代鸡胚成纤维细胞(CEF)中连续传代至25代,对第9、12、15以及25代病毒载体基因的稳定性、六种外源基因的稳定性、外源基因表达的稳定性以及外源基因的丢失率进行研究。结果显示:各代病毒均保持了非复制型天坛株痘苗病毒载体特点且传代稳定;HIV-1目的基因序列与原设计序列相符、重组位点正确且遗传稳定,连续传25代核苷酸突变率低于万分之一;目的蛋白在各代rNTV-C中均能有效表达,而且各代病毒之间表达量和分子量无明显差别;以Gag和Nef蛋白表达为标记,rNTV-C各代病毒的基因丢失率均在5%以下。本研究结果为疫苗生产提供了确保毒种稳定的关键资料。     

密码子偏性对痘苗病毒载体表达效率影响的研究

为了研究密码子偏性对痘苗病毒载体表达效率的影响,分别采用痘苗病毒及其宿主细胞的优势密码子对绿色荧光蛋白基因进行改造,利用荧光、Western blot和FCM等方法分析其在痘苗病毒载体系统的表达水平。结果显示,全部采用痘苗病毒优势密码子(富含A T)和全部采用宿主细胞优势密码子(富含G C),以及部分使用宿主细胞优势密码子的三种绿色荧光蛋白基因都能够有效表达,表达水平相近,表明痘苗病毒载体对目的基因密码子的使用具有很好宽容性。为了探讨这种宽容性的机理,分别利用在胞核内和在胞浆内转录的质粒载体对不同密码子偏性的绿色荧光蛋白基因进行表达分析。结果显示,胞核内转录目的基因的pcDNA3质粒载体能有效表达富含G C的绿色荧光蛋白基因,不能有效表达富含A T的绿色荧光蛋白基因,而胞浆内转录目的基因的pSCA质粒载体能同样有效表达上述不同密码子偏性的目的基因。这些结果表明,位于胞浆内的富含A U的转录产物能够有效表达,细胞核内生成的富含A U的转录产物可能受核膜屏障或其它核内因素影响而不能有效表达。因此,胞浆内繁殖的特性是痘苗病毒载体具有密码子宽容性的主要原因。此研究为痘苗病毒载体和常用真核表达载体的选择使用提供了重要实验依据。     

多种HIVB′/C亚型基因在复制型DNA疫苗中表达及免疫效果研究

为了解多种HIVB′/C亚型基因在复制型DNA疫苗中表达水平及对免疫效果影响,使用复制型DNA疫苗载体pSCK2,分别构建了7种含单种或多种HIVB′/C亚型基因gagpol、gp160和rtn(rev、tat和nef融合基因)的DNA疫苗质粒。免疫荧光检测表明,Gag、Gp160、Rev、Tat和Nef蛋白均能从相应7种DNA疫苗中表达,单基因表达质粒中的基因表达水平和双基因表达质粒中IRES上游的基因表达水平普遍较好。小鼠免疫后,Gag能诱发较高的抗体滴度,Gp160、Pol和RTN的抗体滴度很低;比较研究显示,Gag单独表达和Gag与RTN双表达的质粒均能诱发较好的Gag抗体反应,但Gag与Gp160双表达质粒免疫或含Gag、Gp160和RTN质粒联合免疫的Gag抗体反应均较弱。ELISPOT检测表明,7种DNA疫苗单独或不同组合方式免疫均能诱发针对Gag、Pol、Gp160、Tat和Nef的细胞免疫反应;单基因表达质粒单独免疫诱发的细胞免疫反应最好,含gagpol和gp160双基因表达质粒单独免疫或与含其它基因质粒联合免疫诱发的Gag、Pol和Gp160细胞免疫明显低于含Gagpol或Gp160单基因质粒诱发的相应免疫反应,但诱发的Tat和Nef细胞免疫与相应单基因质粒免疫组无明显差别。本研究结果显示,不同表达构建体的多种HIVB'/C亚型的基因gagpol、gp160和rtn均能从pSCK2质粒中较好地表达;不同基因结构和不同组合免疫的优化,特别是含gag和gp160基因疫苗联合免疫程序的进一步优化对提高其免疫效果是必要的。     

SARS-CoV N蛋白与人冠状病毒HCoV-OC43和HCoV-229E的交叉反应表位及特异表位的确定

为确定SARS-CoV N蛋白的特异抗原表位,对3种人冠状病毒SARS-CoV、HCoV-OC43和HCoV-229E N蛋白之间的交叉免疫反应进行了系统研究。构建了分别表达SARS-CoV、HCoV-OC43和HCoV-229E N蛋白的重组痘苗病毒,并制备了相应的小鼠免疫血清。用间接免疫荧光方法,检测了3种N蛋白的表达及其与3种冠状病毒免疫动物血清和SARS病人恢复期血清之间的反应。与此同时,用Western blot方法分析了原核表达的39个不同区段的SARS-CoV N蛋白与3种冠状病毒动物免疫血清和SARS病人恢复期血清之间的交叉反应性。免疫荧光检测结果表明,SARS-CoV、HCoV-OC43和HCoV-229E3种病毒的N蛋白在重组痘苗病毒感染的HeLa细胞中均可以特异表达;3种N蛋白之间存在明显交叉免疫反应。Western blot结果显示,SARS-CoV N蛋白的表位主要位于30~60aa、170~184aa、301~320aa和360~422aa;与HCoV-OC43的交叉反应表位主要位于30~60aa、90~120aa、204~214aa和320~360aa;与HCoV-229E的交叉反应表位主要位于30~60aa、150~160aa和301~360aa。含SARS-CoV N蛋白特异表位的重组肽N155b(60~214aa)和N185(30~214aa)只与SARS病人恢复期血清和灭活SARS-CoV免疫小鼠的血清反应,而不与灭活HCoV-OC43和HCoV-229E免疫的山羊血清产生交叉反应。上述结果为使用SARS-CoV N蛋白抗原进行特异诊断试剂的研究,提供了重要的实验依据。