重组枯草芽孢杆菌分泌表达缺陷假单胞菌磷酸三酯酶及其发酵优化

磷酸三酯酶(phosphotriesterase, PTE, EC3.1.8.1)能够水解有机磷化合物,但其应用一直受限于酶表达量低的问题.为了获得高效表达的有机磷水解酶,本文构建了PTE基因来源于缺陷假单胞菌(Pseudomonas diminuta)的重组枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis WB600),并采用单因素实验和正交实验对培养基进行优化,确定了重组菌产酶的最佳发酵条件,同时检测重组酶对有机磷类化合物的降解作用.结果表明,最优的培养基组成为蔗糖(40 g/L)、酵母膏(40 g/L)、蛋白胨(20 g/L)、磷酸氢二钾(2 g/L)、硫酸锰(1 g/L)、硫酸镁(6 g/L).经测定,该酶4 h内对(5 mg/mL的甲基对硫磷、乐果以及神经毒剂模拟剂甲基磷酸二甲酯(dimethyl methyl phosphonate, DMMP)的降解率分别达到98%, 92%, 73%,且DMMP在12 h内也完全降解.本文实现了PTE的胞外分泌表达,为研制有机磷化合物的酶基消毒剂提供了技术支持.     

地衣芽胞杆菌FLP/FRT基因编辑系统的构建及验证

地衣芽胞杆菌有效的基因编辑工具有限,为了拓展和丰富其基因编辑手段,在地衣芽胞杆菌中构建一个抗性标记可重复使用的FLP/FRT基因编辑系统,并通过敲除α-淀粉酶基因amyL、蛋白酶基因aprE及敲入外源透明颤菌血红蛋白基因vgb对该系统进行初步验证。首先以温敏质粒pNZT1为载体分别构建amyL和aprE基因敲除质粒pNZTT-AFKF和pNZTT-EFKF,两个敲除质粒各自包含针对目标基因的同源臂、抗性基因及同向的FRT位点;将敲除质粒转化地衣芽胞杆菌并经过两次同源交换过程实现目标基因的敲除;最后导入一个FLP重组酶表达质粒通过FLP/FRT系统的重组作用介导抗性基因的回收。为进一步验证本系统的实用性及编辑效率,构建了包含透明颤菌血红蛋白编码基因vgb表达盒及基因组丙酮酸甲酸裂解酶编码基因pflB敲除盒的重组质粒pNZTK-PFTF-vgb,并以此进行外源基因vgb在基因组上的定向敲入。结果显示,成功敲除amyL及aprE并回收了抗性标记卡那霉素基因,敲除后淀粉酶活和蛋白酶活分别减少95.3%和80.4%;vgb基因成功整合入基因组pflB位点并回收了抗性标记四环素基因,并利用荧光定量PCR技术检测到vgb的整合表达。文中首次建立了一个适用于地衣芽胞杆菌的、抗性标记可重复使用的FLP/FRT基因编辑系统,并进行了基因敲除及基因敲入验证,为地衣芽胞杆菌遗传改造提供了良好的方法参考。     

五株木糖利用酵母的生理代谢特性

摘要:【目的】木质纤维素是地球上最丰富的可再生资源,筛选具有高抗逆和高效利用木糖能力的菌株对纤维素类可再生资源综合利用具有重大意义。【方法】论文以5株利用木糖的酵母,即树干毕赤酵母(Scheffersomyces stipitis,S.stipitis)、Candida tenuis (C.tenuis)、Spathaspora passalidarum (S.passalidarum)、Candida amazonensis(C. amazonensis)和Candida jeffriesii(C. jeffriesii)为研究对象,研究了其对温度、乙醇浓度、渗透压的耐受性,采用杜氏小管实验研究了其对常用碳源和氮源的利用能力,另外通过木糖发酵实验初步研究了被测试酵母在有氧和限氧条件下的木糖发酵性能。【结果】结果表明,S. passalidarum能够耐受44 ℃左右的高温,对多种碳源和氮源具有较强的利用能力,此外,S. passalidarum在有氧与限氧条件下均能快速代谢木糖,限氧条件下乙醇得率达0.43 g/g。C. amazonensis对纤维二糖具有较强发酵能力,代谢木糖产生木糖醇和少量乙醇,同时该酵母耐受温度在42 ℃左右。综合比较,其他酵母在实验过程中没有表现出明显优势。【结论】S. passalidarum 在纤维素工业化应用中是一株良好的生产候选菌株。此外,C. amazonensis具有较强的木糖醇生产能力,有望成为一株优良的木糖醇生产菌株。     

新型类胡萝卜素的分离提纯及结构鉴定

利用高压液相色谱技术(HPLC)及红外光谱(IR)、质谱(MS)、紫外光谱(UV)等现代测试手段,对微球菌产生的一种未知新型类胡萝卜素进行了分离纯化与结构鉴定.研究结果表明,该未知新型类胡萝卜素的分子量为536,分子式为C40H56,结构是全反式对称结构.共有12个共轭双键(番茄红素为11个),根据已报道的研究,可以基本确定是一种新型的类胡萝卜素.     

不同启动子调控羰基还原酶基因在枯草芽胞杆菌中的表达水平

为了实现羰基还原酶基因mldh在枯草芽胞杆菌中的高效表达,以摩氏摩根菌MorganellamorganiiCMCC（B）49208染色体DNA为模板,PCR扩增得到目的基因mldh,分别与启动子PQ和启动子p43进行连接,构建不同启动子组合的表达载体PHY—p43-mldh、PHY—PQ—mldh、PHY—p43-p43-mldh和PHY—p43-PQ—mldh,化学法转化B．subtilisWb600后对重组茵细胞破碎液进行SDS-PAGE分析及全细胞生物转化反应实验发现,4种重组茵的转化能力差异显著,其中重组菌B．subtilisWb600（PHY—p43-p43-mldh）进行全细胞转化反应,转化液中d-伪麻黄碱的浓度最高,达到142．1mg／L,底物转化率为78．25％,成功实现了羰基还原酶基因mldh在枯草芽胞杆菌中的高效表达。     

谷氨酸棒杆菌L-天冬氨酸α-脱羧酶在大肠杆菌中的表达及酶转化生产β-丙氨酸

【目的】克隆谷氨酸棒杆菌来源L-天冬氨酸α-脱羧酶基因, 实现其在大肠杆菌中的异源表达, 并进行酶转化L-天冬氨酸合成β-丙氨酸的研究。【方法】PCR扩增谷氨酸棒杆菌L-天冬氨酸α-脱羧酶基因pand, 构建表达载体pET24a(+)-Pand, 转化宿主菌大肠杆菌BL21(DE3), 对重组菌进行诱导表达, 表达产物经DEAE离子交换层析和G-75 分子筛层析纯化后进行酶学性质研究, 然后进行酶转化实验, 说明底物和产物对酶转化的影响。【结果】重组菌SDS-PAGE分析表明Pand表达量可达菌体总蛋白的50%以上, AccQ·Tag法检测酶活达到94.16 U/mL。该重组酶最适反应温度为55 °C, 在低于37 °C时保持较好的稳定性, 最适pH为6.0, 在pH 4.0?7.0范围内有较好的稳定性。酶转化实验说明: 底物L-天冬氨酸和产物β-丙氨酸对转化反应均有抑制作用; 实验建立了较优的酶转化反应方式, 在加酶量为每克天冬氨酸3 000 U时, 以分批加入固体底物L-天冬氨酸的形式, 使100 g/L底物转化率达到97.8%。【结论】重组L-天冬氨酸α-脱羧酶在大肠杆菌中获得高效表达, 研究了酶转化生产β-丙氨酸的影响因素, 为其工业应用奠定了基础。     

重组大肠杆菌表达铜绿假单胞菌溶血性磷脂酶C

[目的]构建产溶血性磷脂酶C (Hemolytic Phospholipase C,PLCH)的重组大肠杆菌(Escherich coli菌株,并初步优化其发酵条件.[方法]首先利用卵黄硼砂平板分离法筛选到一株产磷脂酶C(Phospholipase C,PLC)活性较高的菌株,命名为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)41;进一步以P.aeruginosa 41基因组DNA为模板设计引物,PCR扩增获得溶血性磷脂酶C(PLCH)基因,构建重组大肠杆菌表达质粒并转化大肠杆菌E.coli BL21 (DE3);筛选转化子并检测PLC活性和溶血能力,并初步优化其发酵条件.[结果]成功构建了重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3) /pET28a-plcH;在硼砂卵黄平板上对重组菌进行PLC活性测定,显示重组菌有明显的磷脂酶C活性;在哥伦比亚血琼脂平板上对重组菌进行溶血性试验,表明PLCH具有较强的溶血活性;初步优化摇瓶发酵条件为:5％转接量,37℃、200 r/min下培养4h添加IPTG至终浓度为0.9 mmol/L,转为25℃、150 r/min诱导培养14 h;优化后重组菌的酶活可达到722.89±0.47 U/mL.[结论]本文成功构建了一株产溶血性磷脂酶C活性较高的重组大肠杆菌菌株,并通过优化发酵条件使其酶活达到了722.89±0.47 U/mL,本实验在国内首次实现了铜绿假单胞菌来源的溶血性磷脂酶C基因在大肠杆菌的胞内表达,该研究为研究磷脂酶C产业化奠定了一定的基础.     

绿茶糖苷类香气前体的GC-MS和HPLC-ESI-MS~n分析

采用高效液相色谱-电喷雾多级串联质谱法(HPLC-ESI-MSn)并结合气相色谱-质谱法(GC-MS)分析鉴定了绿茶中的糖苷类香气前体物质。茶样经甲醇提取,HPD-500大孔吸附树脂分离富集糖苷,GC-MS跟踪监测酶解后挥发性苷元,然后通过电喷雾多级质谱,根据正负离子模式下的准分子离子峰和多级质谱裂解碎片,鉴定了13种糖苷类香气前体物质,其中2种糖苷首次发现存在于绿茶中。     

阿魏蘑液体发酵过程菌体形态变化对产漆酶的影响

本文旨在研究阿魏蘑菌体形态与漆酶产量之间的关系。结果显示,玻璃珠的添加可改变发酵过程中菌体形态,漆酶产量在球状菌体条件下高于丝状、絮状菌丝：直径分布在0.2~0.4 mm范围的菌球对漆酶的合成具有明显的促进作用;适合的葡萄糖、玉米粉和麸皮添加量,对直径在0.2~0.4 mm范围的菌球形成具有重要影响。此外,添加惰性载体同样可以控制菌球的直径分布,但对漆酶的合成无促进作用。     

对羟基扁桃酸合酶基因的克隆表达及催化特性

【目的】比较两种不同来源基因重组的对羟基扁桃酸合酶(HmaS),考察其在大肠杆菌中的表达效率。【方法】分别对东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)和天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)来源的hmas进行异源表达,经离子交换层析和凝胶过滤色谱分离纯化获得HmaS,并检测HmaS的酶活和催化特性。【结果】来源于S.coelicolor的HmaSSC2比酶活是来源于A.orientalis的3.6倍;来源于A.orientalis的HmaSAO最适反应温度为28°C,在弱碱性条件下的酶活稳定性较好;来源于S.coelicolor的HmaSSC2最适反应温度为35°C,在28-45°C内保持较高的酶活,具有良好耐热性,在pH 7.0左右酶活最高,更易在偏中性的条件下发挥功能。【结论】HmaSSC2更适用于代谢工程改造大肠杆菌发酵法生产扁桃酸。