重组人TNF-α在大肠杆菌表达、纯化及生物学活性鉴定

[目的]获得人TNF-α蛋白,并鉴定其生物学活性。[方法]通过对人源TNF-α序列进行密码子优化构建了p Cold-TNFα原核表达载体,完成了TNF-α重组蛋白的表达,建立了两步分离纯化方案,并利用Western Blot和细胞刺激实验检测了重组人TNF-α蛋白抗原性和生物学活性。[结果]利用大肠杆菌成功表达重组人TNF-α蛋白,经酶切纯化后的人TNF-α蛋白不含标签序列,纯度达95%,收率约70%,并具有良好的生物学活性。[结论]获得具有生物学活性的人TNF-α蛋白,为进一步的中和抗体研究奠定了基础。     

HIV-1 gagpol病毒样颗粒疫苗免疫小鼠的实验研究

目的:为构建含中国流行株HIV*1核心蛋白(gag、pol)基因的病毒样颗粒疫苗(VIP疫苗),并评价其诱导的体液和细胞免疫反应效果.方法:将重组质粒pcDNA3.1/gagpol稳定转染HEK293细胞,上清液经蔗糖垫层超速离心纯化后,用收获的VLP疫苗免疫小鼠,通过ELLSA检测免疫小鼠的特异性抗体和IFN-γ,通过乳酸脱氢酶(LDH)实验检测小鼠特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应.结果:VLP疫苗免疫组小鼠血清的抗HIV-1 gp160抗体滴度和IFN-γ均升高(P<0.01).其特异性CTL活性均高于PBS对照组(P<0.01).结论:构建的VLP疫苗免疫小鼠可以诱导特异性体液和细胞免疫应答,为进一步研制HIV治疗性疫苗奠定基础.     

东亚钳蝎K+通道阻断肽cDNA的克隆与表达

目的：克隆东亚钳蝎毒素基因,以进一步研究其生物学和药理学功能。方法：利用已知蝎神经毒素基因序列,设计引物,用RT-PCR方法克隆从蝎毒腺组织蝎毒素cDNA。结果：成功地克隆了一个新的东亚钳蝎毒素基因,该基因开放阅读框架编码59个氨基酸残基,其中前22个为信号肽,成熟肽为37个氨基酸残基,经PCR扩增除去信号肽序列,克隆到pTreHisA质粒中,在E．coli中表达了分子质量为7ku左右融合蛋白,表达产物占菌体总蛋白的21％左右。结论：其结构中含有三对二硫链,6个Cys残基组成蝎K^ 通道毒素共同特征序列-CXXXC-、-GXC-、-CXC-,推断其为K^ 通道阻断肽,命名为KChTX1。已被Gene-bank收录,收录号为AY129234。     

蛇毒纤溶酶Alfimeprase在大肠杆菌中的可溶表达和纯化

Alfimeprase是Fibrolase的突变体,是一种蛇毒纤溶酶,有纤溶活性而无出血性。根据Alfimeprase的氨基酸序列和大肠杆菌密码子偏爱性,利用PCR的方法合成Alfimeprase DNA序列,分别融合在NusA和MBP的C端,与分子伴侣FkpA在大肠杆菌Origami B(DE3)中共表达,融合蛋白NusA/Alfimeprase以部分可溶的形式存在,可溶部分占上清总蛋白的25%左右,通过镍柱亲合层析纯化和肠激酶切割得到具有纤溶活性的重组蛋白Alfimeprase。本研究是首次报道在大肠杆菌中可溶表达Alfimeprase,为以后深入研究其功能及应用奠定了基础。     

蛇毒纤溶酶Alfimeprase在毕赤酵母中的优化表达及活性鉴定

摘要 Alfimeprase(ALF)是蛇毒纤溶酶Fibrolase的N端突变体,有纤溶活性而无出血活性。通过双酶切从克隆载体上获取目的基因alf,并将其克隆至毕赤酵母分泌型表达载体pPICZα A,经高效电转化、Zeocin筛选鉴定及培养条件pH、每天甲醇流加终浓度、菌体生长密度和甲醇诱导时间的优化,获得了重组ALF(rALF)高表达菌株pPICZ? A-alf / GS115,且在优化条件下rALF的最高产量达425 mg/L。通过His•bind柱纯化后,rALF纯度高达95 %,SDS-PAGE和Western blot分析表明rALF的分子量约为24 kDa,且能与一抗特异结合。纤维蛋白平板法纤溶活性鉴定结果进一步说明rALF获得了高活性分泌表达。这即为ALF的深入研究和工业化生产应用奠定了重要基础。     

细胞骨架蛋白4荧光免疫层析检测方法的建立

采用基于免疫层析技术与荧光微球标记技术相结合的方式,建立一种快速、简单的定量检测肝癌肿瘤标记物的方法。依据双抗体夹心原理,将细胞骨架蛋白4(CKAP4)配对抗体分别作为标记与包被抗体,羊抗兔多抗作为质控线包被抗体,制备CKAP4荧光免疫层析试纸条,并对试纸条的线性、精密性、稳定性等各项性能指标进行评价。结果表明,采用时间分辨荧光微球所制备的CKAP4免疫层析试纸条灵敏度高,特异性好,精密性在15%以内,回收率在85%–115%之间,线性范围为25–1 000 pg/mL,可在37℃稳定保存20 d,与商业化的ELISA试剂盒的相关性良好。结论:初步建立了CKAP4荧光免疫层析方法,能够定量检测血清中CKAP4的含量,且具有快速、灵敏、简便、经济、可单人份操作等优点,有望成为肝癌辅助诊疗的新方法。     

一种简单有效的基于阳离子交换层析的重组腺相关病毒纯化方法

本研究旨在探索出一套简单有效的重组腺相关病毒(rAAV)纯化方法,为基因治疗提供有力载体,推进rAAV的基因治疗走进临床.我们选用国际通用的无辅助病毒包装体系,将pAAV-cTnT-eGFP,pAAV-R2C9和pHelper三种质粒共转染HEK293T细胞系进行病毒包装,并通过荧光显微镜观察包装效率;应用阳离子交换层析法对收获处理后的病毒液进行纯化,包括第Ⅰ轮高pH下的除杂纯化和第Ⅱ轮以严格密集梯度洗脱为特点的进一步纯化.通过SDS-PAGE和Western Blot(WB)对纯化产物进行检测,使用Q-PCR法测定病毒滴度,最后再通过透射电镜对病毒颗粒进一步验证和分析.荧光显微镜结果显示,病毒包装效率较高,可达70％～80％;SDS-PAGE结果表明病毒纯化效果显著,第Ⅰ轮纯化除去了大量的蛋白杂质,第Ⅱ轮纯化也明显除去部分杂质;WB和电镜结果证明,纯化产物实为rAAV病毒,经Q-PCR测得病毒的滴度可达2.15X1012GC/mL,而且电镜进一步观察到我们纯化的终成品病毒中空颗粒含量极少,包含基因的实心颗粒占比可达99％.本研究成功开发出了一套的简单方便、切实有效的rAAV纯化方法,并且该方法能有效去除空壳病毒,提高包含基因的实心病毒占比.     

人IGF-1在大肠杆菌中的可溶表达和纯化

目的:在大肠杆菌中的可溶表达和纯化人胰岛素样生长因子1(hIGF-1)。方法:根据hIGF-1的氨基酸序列和大肠杆菌密码子偏爱性,利用重叠延伸PCR的方法合成hIGF-1DNA序列,构建表达载体,在大肠杆菌OrigamiB(DE3)中与硫氧还蛋白TrxA融合表达,并通过盐析和镍柱亲合层析进行纯化。结果:SDS-PAGE分析显示,重组融合蛋白以可溶形式存在,分子量约为28kDa,占上清总蛋白的50%以上。经盐析和镍柱亲合层析进行纯化,目标蛋白纯度可达到90%左右。结论:复合干扰素在大肠杆菌中的高效可溶表达。     

piRNA：一类新的非编码小RNA

piRNA（Piwi-interacting RNA）是从哺乳动物生殖细胞中分离得到的一类长度约为30nt的小RNA，并且这种小RNA与PIWI蛋白家族成员相结合才能发挥它的调控作用。目前，越来越多的文献表明piRNA在生殖细胞的生长发育中的调控是由于Piwi-piRNA复合物引起的基因沉默导致的，但由于对piRNA的研究尚处于初级阶段，它的一些具体的功能和生源论尚在研究当中。本文主要综述了piRNA的最新研究进展。