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为了获得能够携带较大外源基因的犬2型腺病毒E3区缺失性载体,以犬2型腺病毒全基因组质粒pPolyⅡ-CAV-2及E3区重组质粒pVAX-E3为基础,缺失1381bp的E3区片段(92.6%的E3区全序列),插入Linker-NF(内含NotⅠ、ClaⅠ、FseⅠ多克隆位点),获得重组载体质粒pPolyⅡ-CAV-2-ΔE3(NF)(31.9kb)。以AscⅠ和PmeⅠ双酶切,游离重组基因组,在脂质体LipofectamineTM 2000介导下,转染MDCK细胞系,获得了E3区缺失的重组病毒CAV-2-ΔE3(NF)。通过病毒的形态学观察,血凝性、生长特性、感染性实验证明,该重组病毒与母源病毒没有差异。重组病毒CAV-2-ΔE3(NF)可以作为载体表达外源基因,其外源基因插入片段不小于3.3kb。 相似文献
2.
本试验以犬2型腺病毒全基因组重组质粒pPolyⅡCAV 2及其E3 区重组质粒pVAX E3 为基础,通过DraⅢ和SspⅠ双酶切,缺失第25097bp 26141bp共1044bp的E3区片段,按与编码链相同转录方向插入由CMV启动子、狂犬病病毒SRV9 株糖蛋白基因、SV40 polyA基因构成的总长2424bp的表达盒,获得重组基因组质粒pPolyⅡCAV 2 CGS(34.7kb)。以AscⅠ和ClaⅠ双酶切,游离重组基因组(32.7kb),在脂质体LipofectamineTM 2000 介导下,转染MDCK细胞系,获得了E3 缺失区携带狂犬病病毒糖蛋白表达盒的重组犬2 型腺病毒CAV 2 CGS。Western印迹试验表明,CAV 2 CGS表达了狂犬病病毒糖蛋白。初步接种试验显示,重组病毒可以诱导犬产生狂犬病病毒特异性抗体。 相似文献
3.
试验首先根据GenBank上所发表的狂犬病病毒CVS-24株糖蛋白基因序列,设计并合成一对特异性引物,通过反转录 聚合酶链式反应(RT-PCR),获得糖蛋白全长cDNA,连接在pMD18-T载体上,测序证明克隆的正确性后,将其插入真核表达载体pIRES1neo,构建了糖蛋白单一表达载体pICG,表达质粒通过脂质体转染BHK-21细胞,在G418抗性压力下出现细胞克隆,通过PCR检测,确定启动子与糖蛋白基因在细胞基因组中共同整合。借助Western blot检测,证明所表达的糖蛋白与狂犬病抗血清有特异的反应性。采用间接ELISA法,筛选出3株高效表达糖蛋白的细胞株,分别命名为ICG1、ICG2、ICG3。 相似文献
4.
目的:探讨牛乳铁蛋白肽在转基因鼠乳汁中的表达及其抑菌活性。方法:将实验室构建并保存的包含山羊β-酪蛋白基因启动子和牛乳铁蛋白肽基因的乳腺特异表达载体PI-bcp-LfcinB,用Xho I和Nru I双酶切,得到含有全部表达盒的显微注射DNA片段,采用常规显微注射技术获得转基因小鼠。并通过对泌乳期转基因雌鼠乳腺组织的RT-PCR检测,确定了牛乳铁蛋白肽在mRNA水平的表达,同时利用琼脂板扩散法检测了转基因鼠乳汁中表达产物的抑菌活性。结果:获得了牛乳铁蛋白肽转基因小鼠,且转基因小鼠乳汁中能够表达具有抑菌活性的牛乳铁蛋白肽。结论:通过转基因动物乳腺可以获得具有生物活性的牛乳铁蛋白肽,为进一步研究抗菌肽转基因牛、培育抗乳房炎奶牛新品种以及通过建立转基因动物生物反应器进行抗菌肽的大量生产奠定了基础。 相似文献
5.
为了找到一种新的可用于基因及其表达调控元件鉴定的方法,本试验以蚓激酶(LK)作为目的标志基因,分别构建了在巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、逆转录病毒长末端重复序列(LTR)和beta-酪蛋白启动子调控下的三种真核表达载体pICLK、pLLKSN和pIbLK。制备各重组质粒后,以泌乳期羊乳腺作为支持系统,在处于稳定泌乳阶段分别注射400~800μg重组质粒于山羊乳腺组织中。在注射后不同时间采集奶汁,检测纤溶活性。结果显示,蚓激酶的不同重组质粒在注射到乳腺组织之后迅速得到表达,注射后6~9h蚓激酶表达量达到高峰,并可持续至72h以上;不同表达载体间表达量略有变化,但无显著差异。这些结果表明,利用泌乳乳腺组织表达真核蛋白是鉴定真核基因表达快速有效的手段之一。 相似文献
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犬瘟热病毒H蛋白基因重组腺病毒的构建及免疫效果评估 总被引:1,自引:0,他引:1
研究选取犬瘟热病毒H蛋白基因为目的基因,利用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、酶切、连接等方法构建出重组人5型腺病毒穿梭质粒和骨架质粒,两者共转染293AD细胞并包装出重组腺病毒。通过电镜负染、酶切鉴定、Western blot及一步生长曲线测定等方法进行病毒的生物学特性鉴定,证明犬瘟热病毒H蛋白基因重组腺病毒构建正确。犬分别肌肉接种CDV疫苗毒和重组腺病毒,并检测免疫后第14,28,42,56,70,84d时犬血清中抗CDV中和抗体的变化情况。结果显示,犬免疫重组腺病毒后体内产生的抗CDV平均中和抗体水平高于对照组,滴度最高达2-8。研究表明,正确构建的重组腺病毒具有良好的免疫原性,诱导产生的抗犬瘟热病毒中和抗体达到犬最低免疫保护水平,为进一步研发犬瘟热病毒活载体疫苗提供理论依据。 相似文献
7.
丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染是一个世界性的公共卫生问题,该病毒感染后可引起急、慢性肝炎。由于HCV的宿主范围较窄,一直未找到合适的动物模型来研究该病毒的致病机制、免疫预防等,至今也无证据表明动物源的HCV同源病毒可能跨种传播给人类。最近,研究者在小型野生动物(如啮齿类动物、蝙蝠)和家养动物(如犬、马、牛)中相继发现了新型HCV同源病毒(HCV样病毒和GBV样病毒),这些病毒分别属于丙型肝炎病毒属(hepacivirus)或持续性G病毒属(pegivirus),研究这些病毒的基因组结构和生物学特征有助于HCV的起源及其致病机制和免疫等研究。本综述从HCV基本特征、相关病毒谈起,着重介绍新型HCV同源病毒,并探寻其自然宿主,进而讨论了人类重要病原之一HCV的起源问题。 相似文献
8.
犬2型腺病毒通用载体的构建及鉴定 总被引:4,自引:0,他引:4
为了获得能够携带较大外源基因的犬2型腺病毒E3区缺失性载体,以犬2型腺病毒全基因组质粒pPolyⅡ-CAV-2及E3区重组质粒pVAX-E3为基础,缺失1381bp的E3区片段(92.6%的E3区全序列),插入Linker-NF(内含NotⅠ、ClaⅠ、FseⅠ多克隆位点),获得重组载体质粒pPolyⅡ-CAV-2-ΔE3(NF)(31.9kb)。以AscⅠ和PmeⅠ双酶切,游离重组基因组,在脂质体LipofectamineTM2000介导下,转染MDCK细胞系,获得了E3区缺失的重组病毒CAV-2-ΔE3(NF)。通过病毒的形态学观察,血凝性、生长特性、感染性实验证明,该重组病毒与母源病毒没有差异。重组病毒CAV-2-ΔE3(NF)可以作为载体表达外源基因,其外源基因插入片段不小于3.3kb。 相似文献
9.
以质粒pSilencer2.1-U6 Hygro为基础,设计并构建了针对狂犬病病毒(RV)糖蛋白和核蛋白mRNA的共9个siRNA表达载体,转染BHK-21细胞系后,在潮霉素-B的筛选压力下,获得9个稳定转录相关siRNA的BHK-21细胞株。1000TCID50的RV分别感染24孔板内的上述9株细胞,48h后以直接免疫荧光法检测各株细胞上RV的增殖,结果显示,在经不同siRNA表达载体转染的BHK-21细胞中,RV增殖水平有不同程度下降,RV增殖水平最低者为对照细胞的1%,即RNA干扰效应最高可阻断99%RV的感染。针对其中阻断水平超过90%的靶序列G69和N19,人工合成其双链siRNA,瞬时转染BHK-21细胞后,仍可达到80%以上的感染阻断率。本试验为有效阻断RV早期感染提供了新选择,为通过RNAi研究RV的基因组功能提供了新的依据。 相似文献
10.
乳铁蛋白肽基因的合成及其在动物乳腺中的表达 总被引:5,自引:0,他引:5
根据已发表的编码牛乳铁蛋白肽(LfcinB)25个氨基酸的mRNA序列,设计了4条用于合成牛乳铁蛋白肽全基因的引物,用重叠延伸PCR法合成149 bp的牛乳铁蛋白肽基因(包括牛乳铁蛋白信号肽序列、上下游酶切位点和终止密码子),并将此基因克隆到载体pI-B,获得了乳腺特异性表达质粒pI-BL,该质粒经生理盐水稀释后直接注入稳定泌乳期奶山羊和奶牛乳腺组织(注射量为400μg),以琼脂板溶圈法检测奶样抑菌活性。结果显示,注射后3~48 h,奶样有明显抑菌活性,其中3~9 h抑菌活性最高。 相似文献