中国野生毛葡萄VqTLP15基因的克隆与抗病性功能研究

该研究以抗病品种中国野生毛葡萄‘商 24’和感病品种欧洲葡萄‘红地球’为材料,利用 RT PCR 方法克隆TLP15基因,分别命名为 VqTLP15 和 VvTLP15(GSVIVT01018769001),对其进行生物信息学分析、亚细胞定位、转化拟南芥,并接种不同病原菌观察分析转基因株系的抗性,采用qRT PCR 检测SA 和 JA/Eth信号途径以及调控气孔运动的相关基因表达。结果显示：(1)成功克隆获得 VqTLP15 基因的开放阅读框 (ORF);氨基酸序列比对显示,VqTLP15基因与葡萄基因组网站欧洲葡萄‘黑比诺’VvTLP15 和‘红地球’克隆的 VvTLP15基因的同源性分别为 98.99％ 和 99.66％。 (2)亚细胞定位表明,VqTLP15 定位于细胞质。(3)成功获得 VqTLP15 转基因拟南芥株系(L1、 L2、 L3)。(4)接种观察发现：白粉菌处理 7 d后转基因株系对白粉菌的抗性较野生型(Col 0)提高,且其叶片的白粉菌孢子浓度显著低于Col 0;灰霉菌诱导的叶片坏死性损伤在转基因株系(L1、L2 和L3病斑面积>40%的比例分别为 71%、62%和67%)中显著大于 Col 0(43%);接种 PstDC3000后转基因株系叶片的病害表型没有 Col 0 明显,叶片孔径减小程度大于 Col 0,且细菌浓度低于 Col 0。(5)组织化学染色分析表明：白粉菌处理后转基因株系叶片胼胝质沉积、细胞死亡率和 O₂^-·水平都显著大于 Col 0;灰霉菌处理后转基因株系的细胞死亡率、H₂O₂和 O₂^-·水平均高于 Col 0; PstDC3000 处理后细胞死亡率和 O₂^-·积累水平都高于 Col 0。(6)qRT PCR 检测显示：接种白粉菌后,转基因株系中PR1 和 ICS1 的表达水平均升高,PR1 表达在接种72 h时达到峰值,而 ICS1 在 接种120 h时达到峰值,LOX3 的表达水平逐渐降低,并于接种120 h时降至最低水平,但仍高于 Col 0;接种灰霉菌后,转基因株系中 PR1、NPR1 和 PDF1.2 基因的表达均上调,并在接种 48 h时达到峰值,LOX3 基因的表达水平下降,但仍高于 Col 0;接种 PstDC3000 后,转基因株系中 PR1、PDF1.2 和 NHL10的表达均高于 Col 0,但WRKY53的表达低于Col 0, L1 中 COI1、FRK1、ATPPC2、FLS2、OST1 的表达水平高于 Col 0;接种flg22 或 LPS后, L1 中 COI1基因的表达低于 Col 0,但ATPPC2、FLS2、OST1基因的表达水平高于 Col 0。研究表明,过量表达 VqTLP15 基因降低了对白粉菌和 PstDC3000 的敏感性,增加了对灰霉菌的敏感性。 VqTLP15 基因可能通过介导水杨酸 (SA) 和茉莉酸/乙烯 (JA/Eth) 信号转导途径以及气孔免疫反应来参与植物的抗病防御反应,为葡萄抗病分子育种提供了一个可能的候选基因。