转CkLEA4基因拟南芥种子萌发期的抗逆性分析

该研究在实验室前期研究的基础上,将受脱水、盐胁迫和ABA诱导的柠条锦鸡儿CkLEA4基因转入野生型拟南芥,并利用实时荧光定量PCR从8株纯合体中筛选出3个表达量不同的株系,比较野生型和转CkLEA4基因过表达拟南芥种子在不同胁迫处理下的萌发率,以探讨CkLEA4基因在植物抵抗逆境胁迫中的功能。结果发现:(1)在不同浓度NaCl、甘露醇及ABA处理下,转CkLEA4基因过表达拟南芥种子的萌发率均高于野生型,随着NaCl、甘露醇及ABA浓度增加,各株系萌发率均降低,但野生型的萌发率下降幅度均高于3个过表达株系,并且在200mmol/L NaCl和400mmol/L甘露醇处理下,过表达株系子叶绿化率均显著高于野生型。(2)在低浓度ABA处理下,CkLEA4过表达植株子叶的绿化率也高于野生型。研究表明,柠条锦鸡儿CkLEA4基因提高了拟南芥种子萌发阶段对盐、ABA及渗透胁迫的耐受性。     

柠条锦鸡儿CkLEA4基因克隆及表达分析

LEA蛋白是一种与植物抗逆相关的胚胎发育晚期丰富蛋白。该研究从已构建的柠条锦鸡儿干旱胁迫抑制削减杂交文库中筛选到1条LEA蛋白编码基因的部分序列,用RACE技术扩增得到该基因cDNA全长并对其进行了克隆。测序表明该基因cDNA长870bp,其中开放阅读框长510bp,编码169个氨基酸,推测蛋白分子量为17.03kD,等电点为9.3,是一种亲水蛋白。序列比对和系统进化分析表明,该基因属于LEA4基因家族成员,命名为CkLEA4。实时荧光定量PCR检测发现,CkLEA4基因在干旱、ABA和NaCl处理下均受到不同程度的诱导,说明CkLEA4基因可能与柠条锦鸡儿响应逆境胁迫有关。     

中间锦鸡儿转录因子基因 CiNAC1的克隆及功能分析

NAC转录因子家族是植物特有的、最大的转录因子家族之一,在植物应答非生物胁迫和生长发育过程中有重要的功能。该研究通过PCR技术,克隆得到了中间锦鸡儿 CiNAC1基因1 066 bp的cDNA全长序列。生物信息学分析显示, CiNAC1基因的开放阅读框(ORF)为921 bp,编码306个氨基酸,推导的蛋白分子量为34.57 kD,等电点为8.35,是一种亲水性蛋白,N端具有保守的NAM结构域,具有26个磷酸化位点和7个糖基化位点。实时荧光定量PCR检测显示,中间锦鸡儿 CiNAC1基因表达受干旱、高盐、脱水、高pH诱导;亚细胞定位发现CiNAC1定位到细胞核中,这与它作为转录因子的功能是一致的;转CiNAC1基因拟南芥株系侧根数目显著多于野生型,根长也明显比野生型长。研究认为, CiNAC1基因可能与中间锦鸡儿响应逆境胁迫机制有关。     

中间锦鸡儿CiNAC1基因促进转基因拟南芥叶片的衰老

NAC转录因子家族是植物特有的、最大的转录因子家族之一,参与植物生物胁迫和非生物胁迫应答、激素信号转导、植物次生生长、细胞分裂和植物衰老等多种过程,在植物生长发育过程中起着重要的作用。以中间锦鸡儿Ci NAC1基因的过表达拟南芥纯合体株系为材料,以野生型为对照,对Ci NAC1基因功能进行分析。结果发现,乙烯处理后,Ci NAC1基因过表达株系与野生型拟南芥相比,叶片衰老提前、叶绿素含量降低、离子渗透率升高。实时荧光定量PCR检测发现,乙烯处理后Ci NAC1基因过表达株系中与叶绿素降解相关的基因SGR1、SGR2、PPH,以及与衰老相关的基因SAG13、SAG29、ORE1、SINA1、VNI2和乙烯信号途径中的重要转录因子EIN3的表达量均明显高于野生型拟南芥。表明Ci NAC1基因在乙烯诱导的叶片衰老过程中发挥重要作用。     

中间锦鸡儿CiPUB22基因克隆与功能分析

中间锦鸡儿(Caragana intermedia)耐旱、耐寒、耐盐碱,是西北干旱地区的重要固沙灌木,筛选其优良抗逆境基因,可以作为林草基因工程的基因源。该研究在中间锦鸡儿干旱胁迫转录组文库中找到1条CiPUB22 (plant U box 22)基因的cDNA全长序列,CiPUB22基因包括1 260 bp开放阅读框,编码419个氨基酸。实时荧光定量PCR结果表明,在脱水、盐和ABA处理1 h后CiPUB22基因表达量上升并达到最高水平,分别为对照表达量的12倍、35倍和7倍,干旱处理后12 d达到最高值,为对照的2.5倍,表明CiPUB22的转录水平受非生物胁迫诱导。构建CiPUB22基因的过表达载体并转化野生型拟南芥,对转基因纯合体株系抗逆性分析发现,在150 mmol/L NaCl、1 μmol/L ABA和400 mmol/L甘露醇处理下,过表达株系的萌发率均低于野生型,说明过表达CiPUB22基因降低了拟南芥在种子萌发过程中对盐和渗透胁迫的耐受性。