大别山野生油茶中茶氨酸检测与茶氨酸合成酶基因克隆

茶氨酸是茶树叶片中最丰富的游离氨基酸,具有重要的生理药理功能,但迄今仅在蘑菇、蕈和一些山茶科(属)植物中检测到茶氨酸。茶氨酸因有一种独特的风味特色"umami鲜爽味"而被人类营养学广泛研究,并发现合成茶氨酸的植物不仅在植物分类上具有积极意义,而且对于植物资源的有效发掘有巨大经济价值;同时还可以间接去研究茶树中茶氨酸的代谢机理以及茶氨酸合成酶的分离纯化和TS基因的克隆表达。该文运用HPLC、LC-TOF/MS对大别山地区野生幼年与成年油茶根、叶中茶氨酸进行检测,并结合分子生物学手段对油茶中茶氨酸合成酶(theanine synthetase,TS)基因进行克隆与生物信息学分析。结果表明:在幼年的油茶根中检测到茶氨酸,含量为0.08mg·g-1(鲜重),而在幼年的油茶叶片和成年油茶根、叶中均未检测到茶氨酸;在幼年油茶根中克隆出一条长为1 071bp油茶TS基因开放阅读框,其基因序列与茶树谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS,AB117934)基因和TS(DD410896)序列的同源性达到98%,氨基酸序列与茶树中GS(AB117934)和TS(DD410896)的相似性高达99%。经生物信息学分析,该序列编码的TS蛋白具有20个磷酸化位点,不存在信号肽序列与跨膜结构,含有卷曲螺旋结构的亲水性细胞质蛋白。该研究将为油茶新经济价值的发掘,为茶氨酸在油茶中合成代谢途径的研究提供一定的理论基础,同时也为进一步研究茶氨酸在茶树中代谢机理提供了新的研究思路。     

无花果曲霉原生质体形成与再生条件的探讨

根据正交试验得出无花果曲霉原生质体形成的最佳条件,用１％的混合酶液（０．５％纤维素酶＋０．２５％蜗牛酶＋０．２５％溶菌酶）作用无花果曲霉菌体细胞,原生质体产量达３．２×１０７个·ｍｌ－１,渗透压稳定剂为０．６ｍｏｌ·Ｌ－１ＫＣｌ于０．２ｍｏｌ·Ｌ－１ＰＯ３＋４（ｐＨ５．８）中,酶解时间和酶解温度分别为３．０ｈ、３０℃．比较不同酶解时间、再生稳定剂和碳源等因素对原生质体再生的影响,可确定最佳再生条件,再生率达３０％以上．     

复合诱变黑曲霉选育β-葡萄糖苷酶高产菌株

对黑曲霉原生质体进行紫外、ＬｉＣｌ复合诱变,观察诱变后原生质体再生菌落,发现了抱子颜色变异较大的菌株,且其变化与酶产量相关。经发酵筛选,获得卜葡萄糖昔酶活较高菌株,其酶活由出发菌株的１０ｕ／ｍｌ提高到１４．７ｕ／ｍｌ。再对高产突变株进行氮离子注入,酶活又提高２０％（达１７ｕ／ｍｌ）。     

辐照技术应用于茶叶上的研究进展

本文综述了国内外辐照处理对茶叶卫生质量、感官品质、内含物的影响以及农残降解的研究进展,展望了辐照技术在茶叶上的应用前景和发展方向,为辐照技术在茶叶上的产业化应用提供参考依据。     

油茶砧和茶穗嫁接后苗期叶片形态和次级代谢物含量的变化

为了解茶/油茶嫁接苗叶片在形态和代谢产物上的变化,以茶‘舒茶早’品种（Camellia sinensis ‘Shuchazao’）为接穗,大别山野生油茶（C. oleifera）为砧木进行根颈嫁接,对嫁接体、茶树和油茶的叶片形态和次生代谢产物含量进行了研究。结果表明,茶/油茶嫁接体叶片在形态上更接近于茶,而嫁接体叶片形态学指标却受到了油茶的影响。嫁接体叶片中的氨基酸、嘌呤碱和多酚含量比油茶叶片高,其中茶氨酸含量比油茶显著提高。嫁接体叶片中含有酚酸,而在油茶中未被检出。嫁接体叶片中咖啡碱含量比茶树叶片显著下降。这对茶、油茶的栽培,茶树次级代谢及次级代谢物的转运机理研究具有一定的积极作用。     

茶树茶氨酸合成酶基因的酶活性验证与蛋白三维结构分析

针对NCBI上已登录的茶氨酸合成酶与谷氨酰胺合成酶基因序列进行克隆、原核表达与酶活性验证,利用多种生物信息学数据库和软件,对Cs TS与Cs GS基因进行结构、性质和功能预测,采用同源建模法对蛋白三维结构进行预测,比较并预测催化作用位点的差异;用系统进化树分析从裸子植物到高等被子植物的谷氨酰胺合成酶基因序列,推测其进化的演变过程;通过对原核表达的基因工程菌提取粗酶液进行酶活性测定。结果表明:尽管茶树TS与GS序列高度同源,但是原核表达后的融合蛋白仍然显示了不同的催化能力,蛋白一、二级结构分析显示Cs TS与Cs GS差异不大,但是通过同源建模形成的蛋白三级结构分析显示,Cs TS与Cs GS存在3个催化位点上的差异,这可能是导致其酶活性差异的关键。系统进化分析结果首次确定茶氨酸合成酶应为谷氨酰胺合成酶基因家族成员,按照其细胞定位预测应为胞质型GS,其亲缘关系与同为双子叶植物的葡萄、陆地棉、巴西橡胶树、拟南芥较接近。     

茶树紫黄素脱环氧化酶基因的体外定点突变及其突变体的表达和活性鉴定

经Swiss Prot蛋白质数据库中查询发现茶树紫黄素脱环氧化酶 (VDE)蛋白结构中含有lipocalin特征区 ,利用重叠延伸法把该特征区中最保守的Gly(GGG)和Trp(TGG)分别定点突变为Leu(TTG)和Tyr(TAG) .构建了表达载体pET 32a G→L和pET 32a W→Y ,在E .coliBL2 1trxB(DE3)进行了诱导表达 ,并对表达蛋白进行His Tag亲和纯化 .结果表明 ,表达蛋白的分子量和预计的相等 ,为 5 8 9kD ,表达量占菌体总蛋白的 4 5 % .体外酶促反应分析得出 ,G→L或W→Y突变都能导致茶树VDE生物活性大幅度降低 ,证明了lipocalin特征区是VDE的主要活性中心之一 .     

葛根异黄酮对去卵巢大鼠骨质疏松症的影响

通过对3月龄Wister大鼠,手术切除双侧卵巢后7天,每天灌胃TIP40mg/kg和10mg/kg,并设去卵巢组(OVX)、假手术组(Sham)和尼尔雌醇阳性对照组(OVX-E2),在给药3个月时,测定大鼠股骨骨矿密度(BMD)、骨钙及血清钙水平等,研究葛根异黄酮(TIP)对由雌激素缺乏引起的骨质疏松症的防治作用。结果TIP40mg/kg的BMD比去卵巢组显著提高了18.1%;使胫骨和血清钙含量显著增加;使去卵巢大鼠的脾脏重量系数和胸腺重量系数明显恢复;并可明显控制大鼠的体重。葛根异黄酮可能具有雌激素样活性,并有改善骨质疏松症的生物学活性。     

诱导茶树成熟胚培育成幼苗的研究

以茶树品种——农抗早的成熟胚为外植体离体培养,初次研究了2,4-D、6-BA等不同植物激素对茶树成熟胚诱导成幼苗的影响。结果表明,在合适的激素组合条件下,愈伤组织诱导为97%,在附加2.5mg/L 6-BA 0.5mg/L NAA的MS培养基上,愈伤组织的芽分化率为14.2%,附加1.5mg/L NAA的1/2 MS培养基,幼苗的根分化率为5%。     

茶儿茶素氧化机理

在制茶发酵过程中,儿茶素可发生苯骈环化反应而形成茶黄素,茶黄素还可转化成茶萘酚醒、脱氢茶黄素和高聚合物;同时,儿茶素可发生二聚合反应产生原花青素类以及双黄烷醇类等物质;儿茶素还可能与茶没食子素、杨梅甙、阿福豆素、维生素C、茶氨酸发生聚合反应,形成加合物。体外自由基清除实验表明,儿茶素具有优良的抗氧化特性。儿茶素在清除自由基时,自身氧化产生双黄烷醇,也可发生A环的断裂而产生羧酸类物质。