小桐子半胱氨酸蛋白酶家族和相应miRNAs的鉴定及其对低温锻炼的响应

小桐子(Jatropha curcas)是一种极具潜力的能源植物及冷敏植物, 12°C低温锻炼可显著提高其耐冷性。在全基因组水平上对小桐子半胱氨酸蛋白酶家族及靶向其基因的miRNAs进行鉴定、生物信息学分析和表达特性分析, 并对该基因家族成员与miRNAs互作参与调控小桐子对低温锻炼的响应进行解析。结果表明, 在小桐子基因组中共鉴定到39个半胱氨酸蛋白酶基因, 定位于11条染色体上, 可分为6个亚家族(C1A、C2、C12、C13、C14和C15), 编码181-2 158个氨基酸残基的多肽, 均具有Cys和His活性位点。基于miRNA组和降解组测序结果, 发现有283个miRNAs靶向调控小桐子半胱氨酸蛋白酶基因家族的14个成员。对靶向JcDEK1、JcRD21B和JcXBCP3L的miRNAs在12°C低温锻炼过程中的共表达分析表明, 这些miRNAs参与半胱氨酸蛋白酶基因表达的调控, 且这种调控可能与低温锻炼诱导的小桐子耐冷性增强有关。研究结果有助于深入理解小桐子半胱氨酸蛋白酶基因家族功能及其与相应miRNAs的互作, 以及通过互作调控小桐子对低温的响应。     

小桐子JcCIPK2基因的克隆与表达分析

钙调磷酸酶B类似蛋白互作蛋白激酶(CBL-interacting protein kinase, CIPK)是一类植物中特有的丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶,参与多种生物和非生物胁迫响应过程。该实验通过RT-PCR克隆了小桐子(Jatropha curcas L.)JcCIPK2基因cDNA全长序列,采用荧光定量qRT-PCR分析JcCIPK2基因在不同组织及不同处理(12℃和1℃低温、42℃高温、30%PEG、250 mmol/L NaCl、150μmol/L ABA)下的表达模式。结果显示:(1)小桐子JcCIPK2基因开放阅读框全长1 398 bp,编码465个氨基酸,相对分子量为52.95 kD,等电点为8.89。(2)蛋白质结构分析表明,JcCIPK2的N端含有位于第11～265个氨基酸之间的丝氨酸/苏氨酸激酶_蔗糖非发酵-1型相关蛋白激酶3催化域STKc_SnRK3,在激酶结构域内还具有激活环(Activation Loop);C端含有位于第316～430个氨基酸之间的CIPK蛋白激酶调控域CIPK_C,其调控域中含有CIPK家族典型的能与CBL特异性结合的NAF结构域,位于第314～369个氨基酸之间。(3)系统进化分析显示,小桐子JcCIPK2蛋白与同属于大戟科的木薯(Manihot esculenta Crantz.)同源关系最近,序列一致性达87%。(4)qRT-PCR分析表明,JcCIPK2基因在小桐子根、茎、叶中均有表达,经12℃和1℃低温处理后,叶片中JcCIPK2基因的表达都呈现先上调后下调表达的趋势,且都在低温处理24 h的表达量最高,与对照相比分别上调了6.0倍和16.72倍;小桐子JcCIPK2基因在42℃高温、30%PEG、150μmol/L ABA、250 mmol/L NaCl处理下也受到不同程度的诱导表达。研究推测,JcCIPK2基因在小桐子对逆境的响应与适应中起重要作用。     

小桐子低温胁迫下microRNA实时荧光定量PCR内参的筛选与比较

选择合适的内参对实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果的准确性极其重要,在microRNA(miRNA)的qRT-PCR分析中尤为如此。通过筛选适宜分析小桐子低温胁迫下miRNA定量表达的内参,为小桐子及其他物种mi RNA的qRT-PCR分析提供有用的理论参考。基于以前的小RNA-seq结果,以低温处理的小桐子为材料,挑选11个候选内参基因,用实时荧光定量PCR技术检测它们在不同样本中的表达量,采用GeNorm、NormFinder和BestKeeper软件进行表达稳定性综合分析。结果表明,表达最稳定的基因是miR6448和U6,miR6448的Ct值为23左右,表达丰度适中;U6的Ct值为10左右,表达丰度高;因此,miR6448可作为小桐子低温胁迫下表达丰度适中的miRNA qRT-PCR的内参基因;U6可作为小桐子低温胁迫下丰度较高的miRNA qRT-PCR的内参基因。