家蚕Bmyan基因的克隆表达和作为microRNA 7靶基因的验证

microRNAs(miRNAs)是一类长约22 nt的非编码RNA,通过与其靶基因3′端非翻译区(3′-UTR)的结合来调节各项生命活动。克隆表达家蚕Bmyan基因,验证其是否是bmo-miR-7的靶基因对于深入研究家蚕变态发育机制有重要意义。基于同源性检索和PCR扩增,克隆了家蚕Bmyan基因CDS全长,编码476个氨基酸。序列分析表明,家蚕YAN蛋白的氨基酸序列保守,含SAM-PNT和ETs结构域。芯片数据、RT-PCR和定量PCR的检测结果表明,Bmyan在五龄3 d的家蚕头部、体壁、卵巢中高量表达,在其余组织中低量表达或不表达。在幼虫期,Bmyan表达水平相对较低,但在上蔟期和蛹期前4 d高量表达。通过3′RACE克隆了Bmyan基因的3′-UTR。RNAhybrid在线软件预测了其3'-UTR上bmo-miR-7的两个靶位点。构建了含有Bmyan基因3′-UTR和荧光素酶报告基因的转染载体,将该载体与bmo-miR-7的mimics序列共转染到家蚕胚胎细胞系BmE中,通过测定荧光素酶的活性,证明了Bmyan基因是bmo-miR-7的靶基因。本研究为进一步揭示bmo-miR-7和Bmyan在家蚕体内的生物学功能奠定了基础。     

家蚕抗真菌因子BmSPI39对球孢白僵菌入侵的表达响应

【目的】制备家蚕Bombyx mori抗真菌因子BmSPI39的多克隆抗体,分析BmSPI39对球孢白僵菌Beauveria bassiana入侵的表达响应。【方法】利用原核表达和固定化镍离子亲和层析技术获得高纯度的BmSPI39重组蛋白,利用胶内活性染色检测重组蛋白BmSPI39对枯草杆菌Bacillus subtilis蛋白酶A的抑制活性;利用重组蛋白BmSPI39,通过免疫新西兰大白兔制备BmSPI39的多克隆抗体。基于家蚕开放性数据库SilkDB 3.0,分析BmSPI39在4龄第3天至化蛹后1 d家蚕免疫相关组织体壁、中肠和脂肪体中的时空表达特征。利用制备的BmSPI39抗体通过Western blot分析感染球孢白僵菌不同时间后家蚕幼虫和蛹体壁中BmSPI39应答球孢白僵菌入侵的表达响应。【结果】胶内活性染色结果显示,重组BmSPI39蛋白能够强烈抑制枯草杆菌蛋白酶A的活性。酶联免疫吸附结果显示,BmSPI39抗血清的抗体效价达1∶128 000。Western blot和胶内活性染色结果显示,纯化后的BmSPI39抗体能够有效结合不同多聚体化状态下的BmSPI39抗原蛋白。BmSPI39表达数据的热图分析显示,BmSPI39在游走期和预蛹期的家蚕体壁中有表达,在预蛹期的脂肪体中的表达量较高,但在各发育阶段的中肠中均不表达。Western blot分析结果表明,家蚕幼虫体壁中的BmSPI39的表达在感染球孢白僵菌后84 h上调表达,108和120 h下调表达。【结论】本研究成功制备了BmSPI39的多克隆抗体。BmSPI39蛋白的表达能够响应球孢白僵菌入侵,可能参与蛹期家蚕抵御真菌入侵的过程。     

GAL4/UAS系统在转基因技术中的应用研究进展

GAL4/UAS系统是一种转基因技术体系,其原理是利用特定的启动子或增强子,以组织特异性的方式激活酵母转录激活子GAL4的表达,GAL4又以同样的方式引起GAL4反应元件(UAS)-靶基因的转录。GAL4/UAS系统的关键点在于:GAL4基因和UAS-靶基因分别存在于两个转基因系中。GAL4转基因系中有转录激活子,但没有靶基因;在UAS-靶基因系中,转录激活子不存在,因而靶基因处于沉默状态,只有将GAL4转基因系与UAS-靶基因系进行杂交,才可能产生表达靶基因的后代。本文综述了GAL4/UAS系统的建立及其研究应用。     

家蚕转基因载体pBacA3EG的构建及其表达

以家蚕Bombyx mori肌动蛋白A3(actin 3)启动子、增强性绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)基因及SV40的多聚腺苷酸识别序列为元件,经多次克隆,将其插入到piggyBac转座载体中。经PCR、酶切鉴定及测序表明各元件已按正确的方式插入到piggyBac载体中。将构建好的piggyBac表达载体显微注射到胚盘形成前期的蚕卵中,在胚胎早期发育的第3天,通过体视荧光显微镜检测到蚕卵内发出较强的绿色荧光。结果表明该载体构建正确且能在蚕卵中进行表达。家蚕转基因载体的体外瞬时表达不但是成功进行家蚕转基因所必需的第一步,而且其自身也可以应用于基因的功能研究,为家蚕后基因组研究奠定了基础。     

家蚕化学诱变剂及诱导突变体的筛选

在家蚕Bombyx mori基因组计划完成之后,其功能基因组研究成为该领域的最重要课题。突变体是功能基因组学研究的重要材料,因此,通过人为诱导获取大量的突变系统是及其重要的手段。本研究用化学诱变剂ENU、MNU、DES、5-BU、EMS诱导处理家蚕标准品种C108,筛选获得了非滞育红卵,长圆筒茧、小茧、丝胶茧及绵茧突变体,致死突变体及无鳞毛蛾翅突变体。结果还表明： MNU、DES诱变家蚕的突变效率高,注射翅原基比腹部更方便且效果好,化学诱导雄体比雌体的效果好; 在时期上,注射蛹和蛾都有诱导效果。上述突变体大多为致死性突变,推测其可能与致死性基因突变有关。同时,本研究为应用TILLING技术鉴定家蚕更多目的基因突变体提供了有效的材料。     

家蚕光泽小眼(varnished eye)突变基因的精细定位

家蚕(Bombyx mori)光泽小眼(varnished eye,ve)突变体是家蚕突变品种中少数关于家蚕复眼形态异常的自然隐性突变品种之一,表现为成虫复眼小,表面富有光泽,有瘤状突起;小眼数量少且不规则。经典遗传学连锁图谱将ve基因定位在第6连锁群32.2座位,但到目前为止,该突变性状的形成机理仍不清楚。文章以突变品种ve和对照品种Dz为亲本,杂交产生的F1代雄个体与轮回亲本ve雌个体回交产生的BC1代为材料进行ve基因的精细定位。通过对ve低密度连锁图谱分析发现,ve基因被定位在SNP3~SNP6之间,物理图谱距离大约为1.2 Mb。利用1563个BC1代个体构建ve高密度连锁图谱,最终将ve基因定位在SNP5~SNP61之间,物理图谱距离大约为221.8 kb。通过家蚕基因数据库对ve最终定位区域内进行预测基因检索,发现有6个预测基因。对6个预测基因进行生物信息学分析和测序,这些候选基因都有可能参与家蚕复眼形成,但在编码区没有发现ve特异的突变位点;对这些候选基因进行表达分析,发现编号为BGIBMGA013642的候选基因在ve复眼形成过程中的表达量明显比正常对照Dz低,推测该基因为最佳候选基因。     

PI3K和受体型酪氨酸激酶介导家蚕麻痹肽免疫诱导信号的传递

【目的】普遍存在于鳞翅目昆虫中的ENF肽具有非常相似的结构和生理功能, 对昆虫的发育、 免疫、 应激反应等方面都起着重要的调控作用。有研究报道, 作为ENF肽家族成员之一的家蚕Bombyx mori麻痹肽（paralytic peptide, PP）通过激活MAPK来调控家蚕的免疫应答, 但其完整的分子作用机制尚不明确。本研究旨在解析传递家蚕PP免疫诱导信号的分子通路。【方法】首先通过荧光定量PCR检测了多种昆虫细胞系在PP诱导下抗菌肽基因的转录水平, 并利用Western blot检测p38 MAPK的磷酸化水平, 然后利用不同信号传递分子的抑制剂处理BmE细胞筛选参与传递PP免疫诱导信号的分子。【结果】PI3K抑制剂LY294002和受体型酪酸激酶抑制剂Genistein抑制了PP对BmE细胞抗菌肽基因表达的诱导作用; 且BmE细胞和家蚕血细胞在PP的诱导下, Akt和大小约为70 kDa的细胞膜蛋白均出现磷酸化水平的动态变化。【结论】PI3K/Akt信号通路和Genistein敏感性的受体型酪氨酸激酶介导了PP免疫诱导信号的传递。     

cDNA末端快速扩增技术(RACE)的优化与改良

cDNA末端的快速扩增(RACE)法是延伸已知部分外显子序列和克隆全长cDNA基因的主要方法之一。广泛用于许多已知功能基因片段的进一步延伸和全长cDNA的克隆。但由于其过程复杂、涉及多步连续的酶促过程,如反转录、TdT加尾、第二链合成、RACE-PCR扩增及RACE产物克隆等,在实际应用中有许多问题和相当难度,主要针对RACE各步骤中存在的问题进行了分析,并对其优化和改良进行了综述。     

家蚕let-7 microRNA靶基因Bmlin-41的克隆表达与调控

异时性基因调控细胞增殖和个体发育阶段的转换。家蚕异时性基因在家蚕变态发育过程中也很可能具有重要的调控作用,但它们的表达模式、生物学功能以及与micro RNA之间的关系却鲜有报道。本研究首先利用果蝇同源基因lin-41搜索家蚕基因组数据库中相似序列,设计引物扩增Bmlin-41的编码序列,克隆了家蚕Bmlin-41基因CDS,其长度为2 166 bp,编码721个氨基酸,含有B-box和NHL结构域;随后,利用RT-PCR、q PCR技术并结合已有的家蚕全基因组芯片数据研究了Bmlin-41在家蚕中的时空表达模式,发现Bmlin-41在从家蚕胚胎到成虫的发育过程中呈逐渐递增的表达趋势,在五龄3 d不同组织中,于卵巢里表达量最高,精巢和中肠次之,而其余组织中低量表达或不表达;最后,利用3′RACE克隆了Bmlin-41基因的3′UTR,全长1 434 bp,用在线软件RNAhybrid预测发现Bmlin-41的3′UTR上存在bmo-let-7靶位点,构建了含Bmlin-41 3′UTR的双荧光素酶报告基因载体,在S2细胞上共转染Bmlin-41 3′UTR和bmo-let-7的模拟物(Mimics)和拮抗剂(Antagomir),bmo-let-7 mimics显著下调Bmlin-41,bmo-let-7 antagomir显著上调Bmlin-41,证实了Bmlin-41是bmo-let-7的靶基因。以上研究结果为深入研究let-7 mi RNA和Bmlin-41的功能,揭示Bmlin-41和bmo-let-7在家蚕变态发育过程中的调控关系提供了新的线索。     

家蚕母性基因的表达序列标签分析

为了研究家蚕Bombyx mori卵中储存的母性遗传信息,以未受精的肾脏型和正常型蚕卵为材料构建了cDNA文库,并对其随机测序,共获得391条表达序列标签(EST)序列,经拼接后得到374条非重复序列。生物信息学分析发现,172个非重复序列与国际数据库GenBank和silkbase中的已知基因具有较高的相似性。除3个已知母性基因外,其余主要与DNA复制、能量代谢、信号转导、转录、蛋白质结构以及胚胎发育中个体形成等相关。该结果可为进一步研究家蚕胚胎早期发育的调控提供基础数据。