副溶血性弧菌基因敲除方法的建立及应用

目的摸索出一套副溶血性弧菌基因敲除的可靠方案,副溶血性弧菌致病相关基因的敲除对深入研究其致病机制有重要意义。方法通过融合PCR技术将目的基因上下游同源臂融合并克隆到自杀载体pDS132上,将重组质粒转化大肠杆菌S17λpir中,再接合转移到副溶血性弧菌菌株内,经pDS132质粒上sacB基因的反向筛选得到突变株。结果成功构建了副溶血性弧菌RIMD2210633菌株ΔopaR,ΔtoxR和ΔaphA三个基因突变株。结论通过自杀载体同源重组成功获得精确敲除的无痕突变株更有利于基因功能的研究,使后续副溶血性弧菌突变株与野生株的对比研究成为可能。     

鼠疫菌cAMP受体蛋白对毒力相关基因yopD调控的初步研究

目的研究鼠疫菌cAMP受体蛋白（CRP）对毒力相关基因yopD的调控情况。方法利用芯片表达谱和实时定量RT-PCR初步判断CRP对yopD的调控,在获得纯化的his-CRP蛋白后进行体外凝胶阻滞实验（EMSA）证明CRP能否直接结合yopD启动子区,DNase I足迹实验（DNase I footprinting assay）确定yopD启动子区CRP结合位点序列精确序列。结果芯片表达谱和实时定量RT-PCR实验一致证实CRP可能直接负调控yopD,EMSA证明CRP能直接结合yopD启动子区,DNase I足迹实验确定yopD的启动子区上CRP位点的精确序列。结论CRP可能直接负调控毒力相关基因仰D。     

猪链球菌2型全基因组DNA芯片的研制及基因表达谱技术平台的建立

目的：研制猪链球菌2型（SS2）全基因组DNA芯片,建立SS2基因表达谱技术平台。方法：利用SS2全基因组序列,挑选出2194条基因,经PCR扩增出2156条基因并将产物纯化,点样制备芯片;将芯片用于表达谱研究,采用实时定量PCR验证表达谱结果,对芯片进行可靠性分析。结果：芯片杂交数据与实时定量PCR验证显示了较高的相关性,二者相关系数r=0.87。结论：研制了一批SS2全基因组DNA芯片,并建立了基于DNA芯片的表达谱技术平台。     

机械点样DNA微点阵技术及其在基因表达分析上的应用(Ⅰ)

从芯片制作、芯片杂交、芯片扫读与图像分析,基因表达数据分析等方面,详细介绍了机械点样DNA微点阵技术及其应用于多基因表达分析的基本步骤与原理。     

ToxR负调控副溶血弧菌中c-di-GMP的合成

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是世界范围内引起海产品相关食物中毒的主要致病菌,具有很强的生物膜形成能力。ToxR是一种膜结合调控蛋白,对副溶血弧菌生物膜形成具有一定的调控作用,但具体机制尚未见报道。c-di-GMP是一种普遍存在于细菌中重要的第二信使,参与调控细菌的多种生物学行为包括生物膜的形成。本文探究ToxR对副溶血弧菌中c-di-GMP代谢的调控作用。利用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)测定副溶血弧菌野生株(wild-type,WT)和toxR突变株(ΔtoxR)中c-di-GMP水平的差异。挑选c-di-GMP代谢相关基因scrA、scrG和vpa0198为进一步研究的靶标,采用实时定量qPCR实验检测靶基因在WT和ΔtoxR中的转录水平差异;将靶基因调控区DNA序列克隆入pHRP309质粒中无启动子的β半乳糖苷酶基因上游,采用lacZ报告基因融合实验进一步研究ToxR对靶基因的转录调控关系;将重组质粒分别导入含有pBAD33或pBAD33-toxR的EC100lpir中,采用lacZ报告基因融合实验研究ToxR是否能在异体宿主中调控靶基因的表达;PCR扩增靶基因上游调控区DNA序列,并纯化His-ToxR蛋白,用凝胶阻滞实验(electrophoresis mobility shift assay,EMSA)研究His-ToxR与靶基因启动子区DNA序列是否具有结合作用。ELISA结果显示ΔtoxR中c-di-GMP含量显著性高于WT中的,说明ToxR抑制c-di-GMP的产生;实时定量qPCR结果表明WT中scrA、scrG和vpa0198的转录水平显著性高于ΔtoxR中的,表明ToxR抑制它们的转录;lacZ报告基因融合实验结果表明ToxR可抑制副溶血弧菌和EC100lpir中scrA、scrG和vpa0198的启动子区活性;EMSA实验显示His-ToxR能特异性地结合到scrA和scrG的上游调控区DNA序列上,而对vpa0198的上游调控区DNA序列无结合作用。综上所述,ToxR通过直接调控相关酶蛋白基因的转录来抑制副溶血弧菌内c-di-GMP的合成,从而有助于精确调控生物膜形成等细菌行为。     

CalR激活副溶血弧菌Ⅵ型分泌系统1相关基因的转录

【目的】研究副溶血弧菌群体感应(quorum sensing,QS)系统核心调控子AphA和OpaR对calR基因以及CalR对VI型分泌系统1 (type Ⅵ secretion system 1,T6SS1;vp1386-1420)相关基因的转录调控关系。【方法】提取副溶血弧菌野生株(wild-type,WT)和调控子基因突变株的总RNA,采用实时定量PCR (quantitative real-time PCR,qPCR)研究调控子对靶基因的转录调控关系;采用引物延伸实验研究靶基因的转录起始位点,并根据产物的丰度判断调控子对靶基因的调控关系;将靶基因的启动子区克隆入pHRP309质粒的β-半乳糖苷酶基因上游,构建LacZ重组质粒,并将该重组质粒转入WT和调控子基因突变株中,获得LacZ菌株,通过LacZ报告基因融合实验进一步研究调控子对靶基因的调控关系。PCR扩增靶基因的上游调控区DNA序列,并纯化His-重组调控子蛋白,通过凝胶阻滞实验(electrophoreticmobilityshiftassay,EMSA)研究His-重组蛋白对靶基因调控区DNA序列是否具有直接的结合作...     

副溶血性弧菌全基因组DNA芯片的研制和芯片质量的评价

摘要 目的 研制副溶血性弧菌全基因组芯片,建立芯片杂交方法,并对芯片质量进行评价。方法 利用副溶血性弧菌全基因组序列,挑选出4770条基因,PCR扩增各基因并将PCR产物纯化,点样制备芯片;设计了两个质控杂交组合,采用双色荧光杂交策略,对芯片质量进行评价;PCR方法验证部分芯片结果。结果 芯片杂交与理论预期结果以及PCR验证结果完全一致。结论 成功的研制了一批质量良好的副溶血性弧菌全基因组DNA芯片,并建立了基于DNA芯片的副溶血性弧菌比较基因组学技术平台,建立了一套系统的芯片数据分析的标准方法。     

副溶血性弧菌全基因组DNA芯片的研制和质量评价

【目的】研制副溶血性弧菌全基因组芯片,建立芯片杂交方法,并对芯片质量进行评价。【方法】利用副溶血性弧菌全基因组序列,挑选出4770条基因,PCR扩增各基因并将PCR产物纯化,点样制备芯片;设计了两个质控杂交组合,采用双色荧光杂交策略,对芯片质量进行评价;PCR方法验证部分芯片结果。【结果】芯片杂交与理论预期结果以及PCR验证结果完全一致。【结论】成功的研制了一批质量良好的副溶血性弧菌全基因组DNA芯片,并建立了基于DNA芯片的副溶血性弧菌比较基因组学技术平台,建立了一套系统的芯片数据分析的标准方法。     

鼠疫菌毒力调控研究

鼠疫菌通过一系列转录调控子(如CRP、PhoP、RovA和Fur)控制着一些关键毒力因子(如Pla、强毒力岛、III型分泌系统等)的基因表达。鼠疫菌可感应宿主体内信号刺激,紧密调控毒力因子的表达。在这个紧密调控过程中,调控子、毒力相关基因构成了一个动态网络。鼠疫菌在从假结核菌祖先演化的进程中,基因表达调控网络的重塑在鼠疫菌毒力进化过程中发挥着不可取代的作用。     

细菌比较基因组学和进化基因组学

通过比较不同细菌基因组间差异性与相似性,进而深入研究其分子机理,最终与其表型特征联系起来,是为比较基因组学;不同细菌经过长期进化,其基因组在结构与功能上存在着明显的分化,并构成表型进化的遗传基础,大量细菌全基因组测序的完成,细菌进化基因组学应运而生;以比较基因组学为研究手段,细菌进化基因组学可从基因组水平深入认识物种分化、生境适应、毒力进化、耐药性产生蔓延等表型进化过程。