两株海洋真菌的鉴定及其次级代谢产物抑制烟草花叶病毒及抗肿瘤活性

摘要：【目的】通过对2株活性海洋真菌发酵产物提取物抑制烟草花叶病毒和抗肿瘤活性进行研究,为进一步得到活性纯品化合物作为抗病毒及抗肿瘤的先导化合物奠定基础。【方法】菌株发酵产物的粗提物是通过甲醇浸取并在真空条件下蒸干得到的。粗提物中溶于水的部分为水溶性部分,不溶于水的部分为脂溶性部分。通过间接酶联免疫法检测样品抑制烟草花叶病毒的活性,通过四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法（MTT法）检测样品抗肿瘤活性,通过形态及ITS rDNA序列法进行菌株鉴定。【结果】两株海洋真菌抑制烟草花叶病毒活性和抗肿瘤的活性均较高。分子鉴定结果显示,两株真菌分别与Penicillium oxalicum 和 Neosartorya fischeri 的同源性极高。菌株0312F1发酵液的水溶性部分具有抗病毒及抗肿瘤活性,菌株1008F1发酵液的脂溶性部分具有抑制烟草花叶病毒活性,而水溶性部分具有抗肿瘤活性。【结论】菌株0312F1和菌株1008F1发酵液的提取物抑制烟草花叶病毒的活性部位不同,而抗肿瘤活性部位相同。菌株0312F1发酵液提取物的水溶性活性部位对肝癌细胞BEL-7404的抑制效果比对胃癌细胞SGC-7901的抑制效果明显,而菌株1008F1发酵液提取物的水溶性活性部位对胃癌细胞SGC-7901的抑制效果比对肝癌细胞BEL-7404的抑制效果明显。     

美洲商陆抗病毒蛋白研究进展

美洲商陆抗病毒蛋白（pokeweed antiviral proteins,PAP)是一类具多种生物功能和活性的蛋白,本在阐述了该类蛋白的生化等特性的同时,综述了该类蛋白在抗植物病毒,抗动物病毒以及用作免疫毒素等方面的研究进展。     

水稻条纹病毒RNA4基因间隔区的分子变异

应用反转录－聚合酶链式反应（RT－PCR）和单链构象多态性（single-strand conformation polymorphism,SSCP)技术快速检测我国水稻条纹病毒（RSV）RNA4基因间隔区（intergenic region,IR)的分子变异,结果表明,我国RSV RNA4 IR存在分子变异。供试的7个分离物共有4种泳动带型,其中YL、BS、JD、LY分离物完全一致,而YL、BS、YL及JD4个分离物序列完全一致;JN、PJ、SQ3个分离各不一样,序列之间的同源性均在92％－94％之间.IR序列内部具有两个重要的结构特征：（1）有两处反向重复序列,可形成两个明显的发夹结构,其中一个序列比较保守,形成的发夹结构稳定;但中一个发夹结构由于碱基变异导致其稳定性在各个分离物中差异较大;（2）具有插入序列,相对于日本M分离物,我国7个分离物都有一段长19bp的插入序列,这段插入序列比较保守,各分离物之间仅有1－2个碱基的差异。     

马铃薯Y病毒pl基因的克隆与序列分析

利用依据马铃薯Y病毒(PVY)pl基因序列设计合成的一对引物YP1,YP2,以带毒烟草总RNA为模板,通过RT-PCR方法扩增得到了0.83kb的目的条带,测序结果表明为PVY pl基因。通过对PVY P1蛋白氨基酸序列分析发现PVY不同分离物间P1蛋白氨基酸序列存在明显差异,氨基酸序列同源性在64％～94％间。依据P1蛋白氨基酸序列建立了PVY系统关系树并对PVY进行了类型分析。     

水稻条纹病毒中国分离物和日本分离物RNA2节段序列比较

测定了来源于我国水稻条纹叶枯病常年流行区的云南楚雄(CX)及病害暴发区的江苏洪泽(HZ)的水稻条纹病毒(RSV)2个分离物RNA2全长序列,其长度分别为3506bp和3514 bp.与已报道的日本T和O分离物RNA2序列进行比较的结果表明,这4个分离物可分为两组,其中,HZ、T和O分离物为一组,组内分离物之间,RNA2的毒义链(vRNA2)及RNA2的毒义互补链(vcRNA2)上的ORF的核苷酸一致性分别为97.2%～98.0%和96.8%～97.1%,5′端和3′端非编码区的序列则完全一致.但HZ分离物与T分离物的亲缘关系更为密切,其基因间隔区(IR)与T和O分离物的等长.另一组为我国CX分离物,组与组之间,vRNA2及vcRNA2上的ORF的核苷酸一致性分别为95.0%～95.7%和93.9%～94.4%.CX分离物的IR与HZ分离物相比缺失了一段8 nt的片段.5′端非编码区的序列完全一致,但3′末端非编码区有一个碱基的差异.这些结果表明,RSV在自然界的分子变异与其地理分布具有密切的关系.此外,非编码区序列的高度保守性暗示着它们在病毒基因转录和复制的调控方面具有重要的功能.本文还讨论了RSV的分子流行病学.     

水稻条纹病毒两个分离物RNA4基因间隔区的序列比较

通过RT-PCR扩增了我国水稻条纹病毒(RSV)山东济宁(JN)、云南宜良(YL)两个分离物RNA4基因间隔区(intergenic region,IR)序列,并克隆于pGEM-T easy载体上.序列分析结果表明:JN、YL两分离物RNA4 IR均由654个核苷酸组成,两者之间的同源率为92%.JN、YL两个分离物RNA4 IR在AU碱基富集处可形成两个明显的发夹结构,其中一个序列比较保守,形成的发夹结构稳定;但另一个由于碱基变异导致所形成的发夹结构的稳定性在各个分离物中差异较大.这些结果说明了我国水稻条纹病毒存在明显的分子变异.     

水稻齿叶矮缩病毒Pns10蛋白的原核表达、抗血清制备及初步应用

水稻齿叶矮缩病毒Pns10蛋白由基因组片段S10编码。从RRSV福建沙县分离物(RRSV-F)中获取该病毒的全基因组,根据RRSV泰国分离物核苷酸序列设计特异性引物获得S10编码区,利用Directional TOPO克隆技术,将S10连接至克隆表达载体pET100/D-TOPO构建重组质粒,并进行了序列测定和分析。重组质粒经IPTG诱导在BL21star(DE3)E.coli中高效表达约35 kD Pns10蛋白。将Pns10蛋白免疫新西兰大白兔制备了特异性的抗血清,间接ELISA法测定抗血清效价为1∶7 680,Western blot分析表明抗血清特异性强。表达产物及抗血清在Pns10蛋白的结构和功能研究中具有重要的应用价值,制备的抗血清可用于水稻病株和传播介体的检测以及病毒病的诊断。     

毛头鬼伞(Coprinus comatus)中一种抗病毒蛋白y3特性和氨基酸序列分析

食用菌中含有多种抗病毒蛋白，可用于植物保护．利用离子交换层析技术和凝胶层析技术，从食用菌毛头鬼伞中提取到抗植物病毒蛋白y3．实验结果表明,y3是一种糖蛋白，利用Western杂交方法可以在发酵菌丝体和子实体中同时检测到，说明可能是组成型表达．根据其N端氨基酸序列，使用RACE-PCR克隆技术，获得了蛋白的氨基酸序列和部分cDNA序列．浓度为2.0 μg/ml时,蛋白y3对烟草花叶病毒(TMV, 20 μg/ml)侵染心叶烟的抑制率为50％，实验同时表明,y3还可抑制病毒在寄主普通烟Nicotiana tabacum var. K326中的复制．     

抗病毒蛋白抑制植物病毒的应用前景

探索应用外源性抗植物病毒蛋白进行植物病毒病的防治．已经取得了一定的成效;但不同来源的抗植物病毒蛋白,它们的作用机理是不完全一样的．根据近年的研究结果,对这类蛋白的抗病毒作用的机理进行了综述,并对抗病毒蛋白的应用前景进行了展望．     

云南番木瓜环斑病毒的发生及遗传多样性

【目的】明确云南省番木瓜环斑病毒(Papaya ringspot virus,PRSV)发生情况,并对其进行遗传多样性分析。【方法】利用RT-PCR技术,于2011-2012年对采自云南省昆明市、楚雄州、保山市、德宏州、西双版纳州、临沧市、玉溪市、红河州、文山州等地的24个番木瓜、南瓜和罗汉果疑似病样进行扩增、测序,对样品中获得的940 bp PRSV部分cp基因及3′端非编码区的序列应用分子生物学软件MEGA 5进行系统发育分析。【结果】从17个样品中检测到了PRSV,检出率为70.8%,表明该病毒在云南的发生较为普遍。云南PRSV不同分离物间的核苷酸序列变异较大,与其他已报道的PRSV分离物之间的基因组3′端核苷酸序列一致性为81.7%-100%。基于PRSV的CP部分氨基酸序列及基因组3′端核苷酸的系统进化分析结果表明,来自亚洲、北美洲、南美洲和大洋洲的PRSV分离物可以分为2个组,其中第Ⅰ组均为来自中国的分离物,包括了大部分的PRSV云南分离物,第Ⅰ组内分离物间的差异较第Ⅱ组大;第Ⅱ组的分离物来源较为复杂,亚洲、北美洲、南美洲和大洋洲均有分布。基于PRSV CP部分氨基酸序列构建的系统进化树中,各分离物之间没有明显的地理和寄主相关性,而基于PRSV基因组3′端核苷酸序列构建的系统进化树中,除中国大陆分离物和印度分离物外,其他地区的PRSV在进化上与其地理来源有明显的相关性。【结论】PRSV在云南的昆明市、楚雄州、保山市、德宏州、西双版纳州、临沧市、玉溪市、红河州和文山州等地都有不同程度发生,且为害寄主植物涉及番木瓜、南瓜及罗汉果,PRSV侵染罗汉果为云南首次发现。云南PRSV分离物的分子变异很大,但是关于PRSV的分子变异是否与其地理分布及症状表现有关,以及P型和W型的分子区分特征还有待进一步研究。