天花粉蛋白Y14F/R22L定点突变及其活性研究

利用多聚酶链式反应（ＰＣＲ）技术,对天然天花粉蛋白（ｎＴＣＳ）基因在Ｔｙｒ１４和Ａｒｇ２２两个保守残基处同时进行定点突变,即Ｔｙｒ１４变成Ｐｈｅ,Ａｒｇ２２变成Ｌｅｕ,然后克隆到ｐＥＴ－８ｃ高效表达载体上,构建成重组质粒ｐＥＴＹ１４Ｆ／Ｒ２２Ｌ．经序列分析,定点突变的结果与预先设计的完全一致,突变后的天花粉蛋白命名为Ｙ１４Ｆ／Ｒ２２ＬＴＣＳ．将ｐＥＴＹ１４Ｆ／Ｒ２２Ｌ转化到Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３,ｐＬｙｓＳ）中,进行表达．经ＣＭ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ－６Ｂ柱纯化,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ鉴定,纯度可达９０％．ＲＩＰ活性测定显示,Ｙ１４Ｆ／Ｒ２２ＬＴＣＳ的活性比ｎＴＣＳ降低了７．５倍,活性变化不显著,因此,ＴＣＳ的Ｔｒｙ１４和Ａｒｇ２２对维持其活性部位构象并不是必需的．但由于Ｙ１４Ｆ／Ｒ２２ＬＴＣＳ在Ｅ．ｃｏｌｉ中的表达量与ｎＴＣＳ相比明显下降,因此,Ｔｙｒ１４和Ａｒｇ２２可能与ＴＣＳ翻译后的折叠有关．     

Crystal structure of R22L trichosanthin

Ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｉｎ(ＴＣＳ)ｉｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｍｅｍｂｅｒｏｆｒｉｂｏｓｏｍｅｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｓ[1].ＩｔｐｏｓｓｅｓｓｅｓＮｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｒｅｍｏｖｉｎｇａｄｅｎｉｎｅ(ＡＤＥ)ａｔｐｏｓｉｔｉｏｎＡ4324ｏｆ28ＳｒＲＮＡ[2].ＴｈｅａｃｔｉｖｅｐｏｃｋｅｔｏｆＮｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅｈａｓｂｅｅｎｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｔｈｒｏｕｇｈｔｈｅｃｒｙｓｔａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｏｆＴＣＳ,αＭＭＣａｎｄｒｉｃｉｎａｎｄａｓｓａｙｏｆｍｕｔａｎｔｓ…     

neo Trichosanthin及其突变体Y70A neo Trichosanthin的晶体结构研究

天花粉蛋白（Ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｉｎ,ＴＣＳ）的一个亚型,ｎｅｏＴｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｉｎ（ｎ－ＴＣＳ）,及其突变体Ｙ７０Ａｎ－ＴＣＳ被克隆和表达为重组蛋白。用悬滴汽相扩散法得到ｎ－ＴＣＳ和Ｙ７０Ａｎ－ＴＣＳ的晶体。在ＭａｒＲｅｓｅａｒｃｈ面探测器系统上分别收集了０．２０ｎｍ和０．２０５ｎｍ分辨率的Ｘ射线衍射数据。用同晶差值傅立叶法解析了结构。最后晶体学Ｒ因子分别为０．１８３和０．１８４。键长的     

天花粉蛋白Glu189在N-糖苷酶活性中的作用

培养了(E160A,E189A)TCS(天花粉蛋白)的单晶。用浸泡法得到了(E160A,E189A)TCS与Ade复合物的晶体。在MarResearch面探测器系统上分别收集了均为0.20nm分辨率的X射线衍射数据,数据处理用MarScale程序系统完成。用同晶差值Fourier法解析了(E160A,E189A)TCS和(E160A,E189A)TCS-Ade的晶体结构,结构修正利用X-PLOR程序.修正结果,晶体学R因子分别为0.180、0.184,键长和键角的RMS偏差分别为0.0012nm和2.566°、0.0012nm和2.622°。在(E160A,E189A)TCS-Ade中,Ade仍结合在N-糖苷酶活性口袋之中,它夹在Tyr70和Tyr111两个侧链环之间,与Tyr70环近乎平行。这一结果表明:TCS中的Glu160和Glu189同时突变成Ala,仍能与AMP发生N-糖苷酶反应.前文已经证明在(E160A)TCS中Glu189没有援救作用。目前,没有发现Glu189对TCS与AMP的直接作用,但Glu189与其它残基的协同作用及其在TCS与rRNA作用中扮演什么角色,尚待进一步研究。     

天花粉蛋白与FMP复合物的晶体结构

用浸泡法得到了天花粉蛋白（ＴＣＳ）与ＦＭＰ复合物的晶体,在ＳＩＭＥＮＮＳＸ－２００Ｂ面探测器系统上收集了一套２．０分辨率的Ｘ射线衍射数据。用同晶差值傅立叶法解析了复合物的结构,经Ｘ—ＰＬＯＲ程序修正得到了ＴＣＳ—ＦＭＰ复合物的分子结构并找出了１９７个水分子,最后的Ｒ因子为０．１７２,键长和键角的ＲＭＳ偏差分别为０．０１５和２．９２２度。ＴＣＳ—ＦＭＰ复合物中,ＦＭＰ与天花粉蛋白分子有较好的结合,其结合位置正处于根据三维结构和突变体信息推测的Ｎ一糖苷酶活性口袋之中。它的类嘌呤环夹在Ｙ７０和Ｙ１１１两个侧链环之间,与Ｙ７０环近乎平行,其Ｎ７和Ｎ６分别与ＴＣＳ分子的Ｇ１０９４羰基氧和Ｉ７１的Ｎ成氢键,Ｎ３靠近Ｒ１６３的侧链,其磷酸根则伸向活性口袋的底部,与Ｅ１８９、Ｅ１６０和Ｒ１６３等残基作用。     

亚天花粉蛋白突变体(R163H n-TCS和R163Q n-TCS)的晶体结构研究

用悬滴汽相扩散法得到了Ｒ１６３Ｈｎ－ＴＣＳ和Ｒ６１３Ｑｎ－ＴＣＳ的晶体,Ｍａｒ－Ｒｅｓｅａｒｃｈ面探测器系统上分别收集了０．２００和０．２０５ｎｍ分辨率的Ｘ－射线衍射数据,采用同晶差值傅立叶法解析结构,用Ｘ－ＰＬＯＲ软件包进行修正,最后的晶体学Ｒ因子分别为０．１８４和０．１８５,键长偏差分别为０．００１３ｎｍ和０．００１４ｎｍ,键角偏差分别为２．５９０和２．８１５,结构测定显示Ｒ１６３Ｈｎ－ＴＣＳ     

N-glycosidase mechanism of Trichosanthin

Ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｉｎ(ＴＣＳ)ｉｓａｔｙｐｅＩｒｉｂｏｓｏｍｅｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ(ＲＩＰ)[1].ＴｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｉｎａｃｔｉｖｅｒｉｂｏｓｏｍｅｂｅｌｏｎｇｓｔｏｔｈａｔｏｆＲＮＡＮｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ[2].ＴｈｅａｃｔｉｖｅｐｏｃｋｅｔｏｆＮｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅｈａｓｂｅｅｎｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｏｎｔｈｅｓｕｒｆａｃｅｖａｃａｎｔｂｅｔｗｅｅｎｔｗｏｄｏｍａｉｎｓｔｈｒｏｕｇｈｃｒｙｓｔａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ[3]ａｎｄｔｈｅａｃｔｉ…     

(E160A)和(E160D)天花粉蛋白两种突变体晶体结构研究

培养了（Ｅ１６０Ａ）ＴＣＳ和（Ｅ１６０Ｄ）ＴＣＳ的单晶。在ＭＡＲＲｅｓｅａｒｃｈ面探测器系统上分别收集了０．１９３ｎｍ和０．２０ｎｍ分辨率的Ｘ射线衍射数据。数据处理用ＭＡＲＳＣＡＬＥ程序系统完成。用同晶差值Ｆｏｕｒｉｅｒ法解析了突变体的晶体结构,结构修正利用Ｘ－ＰＬＯＲ程序。修正结果,晶体学Ｒ因子分别为０．１７５,０．１７９,键长和键角的ＲＭＳ偏差分别为０．００１１ｎｍ和２．４５７°,０．００１３ｎｍ和２．６７５°。在这两个突变体的结构中均未见到Ｇｌｕ１８９侧链方向的改变。通过对（Ｅ１６０Ａ）ＴＣＳ和（Ｅ１６０Ｄ）ＴＣＳ的结构比较,说明（Ｅ１６０Ｄ）ＴＣＳ活性低于（Ｅ１６０Ａ）ＴＣＳ的原因：这可能是由于在（Ｅ１６０Ｄ）ＴＣＳ中Ｔｙｒ１１１和Ｔｙｒ７０的侧链都具有较大的运动性,使它们与腺嘌呤碱基的芳香堆垛作用减弱,从而导致活性的降低     

R22L天花粉蛋白的晶体结构

培养了R2 2LTCS的单晶 ,在SIEMENSX 2 0 0B面探测器系统上收集了一套 0 .1 91nm分辨率的X射线衍射数据 .数据处理用XENGEN程序系统完成 ,数据使用到 0 .2 2 0nm .用同晶差值Fourier法解析了突变体的晶体结构 ,经XPLOR程序修正得到了R2 2LTCS的分子结构 ,并找到了 6 1个水分子 ,最后R因子为 0 .1 82 ,键长和键角RMS偏差分别为 0 .0 0 1 3nm和 2 .770°.在R2 2LTCS分子中 ,与A1 6 1 ,A1 6 2主链氧成氢键的 2 2位精氨酸被亮氨酸取代后形成的空穴被水分子 2 91和 2 96所占据 ,与 2 2位Arg形成盐键相互作用的 1 6 8位Glu的侧链与TCS相比 ,转动了大约 5 0° ,羧基折向相反方向 ,并通过水分子 2 93与 1 6 5位的Lys侧链氨基桥连 .这些水参与的氢键网络部分代替了原R2 2的作用 .还讨论了二级结构间的保守氢键和盐键对活性口袋构象的影响     

我国第2次空间蛋白质晶体生长实验

1994年7月,在我国返回式卫星FSW-2上进行了第2次空间蛋白质结晶实验.该次实验中的晶体生长状况明显优于首次空间实验结果,参加实验的10种蛋白质中有9种蛋白质在空间长出了晶体,48个样品的单晶产生率达70％以上.其中3种蛋白质在空间长出较大单晶体,能用于X射线衍射实验和收集强度数据.这3种蛋白质中,除了在首次空间实验中长出较大晶体的溶菌酶,还有由于结晶条件优化而结晶效果明显改进的酸性磷脂酶A₂和斑头雁氧合血红蛋白.微重力条件对蛋白质晶体生长的良好效应在本次实验中得到进一步证实.