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从已经建立的易错PCR初级突变文库中筛选得到的16个兼具耐酸、高温稳定、高酶活力的克隆出发,将其作为DNA shuffling的亲本基因,利用DNA shuffling技术,结合易化筛选和96微孔板通量筛选的方法获得耐酸、高温稳定的克隆。并且,对筛选出来的耐酸高温稳定的突变子进行测序分析和同源建模,比较分析β-甘露聚糖酶突变基因序列的生物学信息。经过两轮DNAshuffling,最终筛选得到一个耐酸高温稳定突变体1108,其在90℃时酶活力还能维持在70%;在pH 3.0时酶活力维持在70%;在高温80℃和pH 4.0的条件下,酶活力是野生型的10倍;常规条件下(pH 6.0,40℃),酶活力是野生型酶的5倍。序列比对发现耐酸、高温稳定突变体1108有三个碱基发生了改变(T289A、A535T、T1085C),导致相应的氨基酸发生了改变(Ser97Thr、Val362Ala、Ile179Leu)。根据同源建模结果和氨基酸性质研究发现,突变位点位于催化中心附近,推测第97位的突变与酶的耐酸性和活性有关,第179位和第362位的突变与酶的高温稳定性有关。实验结果为进一步了解β-甘露聚糖酶MAN47的结构与功能之间的关系提供有用参考。 相似文献
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本研究利用易错PCR技术突变假密环菌Armillariella tabescens MAN47 β-甘露聚糖酶野生型基因,PCR产物与大肠杆菌-酿酒酵母穿梭表达载体pYCα上连接,在大肠杆菌DH5α中扩增后电转入酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae,构建了库容为104的初级突变体库,筛选得到耐高温最佳突变株M262。DNS法测得80oC处理30min后最大酶活力为25U/mL,较之野生型最适条件酶活力提高了4.3倍。序列分析表明,突变体有3个碱基发生了突变:T343A/C827T/T1139C,相应的氨基酸改变为Ser115Thr/Thr276Met/Val380Ala,利用SWISS-MODEL数据库同源建模显示,这3个突变氨基酸分别位于第4个β折叠的第6个氨基酸、第6个α螺旋的第1个氨基酸、第10个α螺旋和第11个β折叠之间的转角。 相似文献
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目的应用5-羟色胺(5-HT)、生长抑素(SS)、胃泌素(GAS)、胰高血糖素(Glu)、胰多肽(PP)和P-物质(SP)6种特异性抗血清,对黑龙江林蛙冬眠期和非冬眠期消化道内分泌细胞进行检测。方法应用卵白素-生物素-过氧化物酶复合物(avidin-biotin-peroxidase complex,ABC)免疫组织化学法。结果在冬眠期和非冬眠期黑龙江林蛙消化道内检测到5-HT细胞、SS细胞和Glu细胞,而GAS细胞、PP细胞和SP细胞均未检测到。5-HT细胞分布广泛,存在于黑龙江林蛙冬眠期和非冬眠期从食管到直肠的整个消化道中,在冬眠期分布密度高峰为胃幽门部和十二指肠,而非冬眠期则为胃幽门部;SS细胞分布也较为广泛,在黑龙江林蛙冬眠期和非冬眠期消化道中,除了直肠以外,均有分布,且这两个时期SS细胞的分布密度高峰均在胃幽门部。Glu细胞在冬眠期仅在胃贲门部、胃体、空肠和回肠检测到,而在非冬眠期除以上四个部位外直肠部也检测到了Glu细胞,并且Glu细胞分布密度高峰都在胃体部。结论黑龙江林蛙在冬眠期和非冬眠期消化道中内分泌细胞分布型的不同,可能与机体适应不同时期的生理功能有关。 相似文献
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本研究利用易错PCR技术突变假密环菌Armillariella tabescens MAN47β-甘露聚糖酶野生型基因,PCR产物与大肠杆菌-酿酒酵母穿梭表达载体pYCα上连接,在大肠杆菌DH5α中扩增后电转入酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae,构建了库容为10_4的初级突变体库,筛选得到耐高温最佳突变株M262.DNS法测得80℃处理30 min后最大酶活力为25 U/mL,较之野生型最适条件酶活力提高了4.3倍.序列分析表明,突变体有3个碱基发生了突变:T343A/C827T/T1139C,相应的氨基酸改变为Ser115Thr/Thr276Met/Val380Ala,利用SWISS-MODEL数据库同源建模显示,这3个突变氨基酸分别位于第4个13折叠的第6个氨基酸、第6个α螺旋的第1个氨基酸、第10个α螺旋和第11个β折叠之间的转角. 相似文献
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