利用人U6 snRNA启动子构建RNA干扰质粒载体

RNA干扰技术已经成为基因功能研究等领域的有力工具,构建带有筛选标记的siRNA载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达.为了利用RNAi技术开展生物学研究,在克隆载体pUC19的基础上改造构建了人类细胞小干扰RNA（small interference RNA,siRNA）表达质粒pUC19NU.该质粒具有新霉素抗性标记和真核细胞复制起点,利用连入的人U6 snRNA启动子起始siRNA的转录.以EGFP 和p53为靶基因的干扰实验证明,所构建的siRNA表达质粒可以显著抑制细胞外源性增强绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）及细胞内源性p53蛋白的表达,而且抑制效果具有特异性.     

L-氨基酸脱氨酶的分子改造及其用于全细胞催化法生产α-酮戊二酸条件的优化

酮戊二酸(α-ketoglutaric acid,α-KG)是谷氨酸脱氨基的酮酸产物,作为一种重要的有机酸广泛用于食品、医药、精细化工等领域。为提高L-氨基酸脱氨酶全细胞催化法合成α-KG的效率及产量,首先通过优化全细胞催化剂制备条件及全细胞转化反应条件,包括发酵过程中的温度、诱导剂浓度、诱导剂添加时刻、诱导时间等;全细胞转化过程中的温度、pH、细胞量、转化时间。各个条件优化后以200g/L谷氨酸钠为底物时,产量最终提高了54. 9%,摩尔转化率为39. 6%。其次,通过定点饱和突变对L-氨基酸脱氨酶进行定向进化以提高其催化能力。经过多次突变、筛选,最优突变体E. coli BL21-pET-20b(+)-pm1152催化200g/L谷氨酸钠生成α-KG最高产量为100. 9g/L,摩尔转化率为64. 7%,较最初对照菌株提高了66. 3%。结果表明,条件优化和饱和突变可有效提高重组大肠杆菌全细胞转化合成α-KG的能力。     

EV71灭活疫苗（人二倍体细胞）在恒河猴婴猴模型中的免疫保护性分析

肠道病毒71型作为引起儿童群体常见传染性手足口病（HFMD）的主要病原,具有导致少量感染个体出现脑炎等神经系统病变以及相关心肺功能衰竭的病理学特性．因此其预防性疫苗的研发具有重要的公共卫生意义．在前期工作的基础上,一种EV71灭活病毒疫苗（人二倍体细胞）在本研究中基于恒河猴婴猴模型进行了相应的免疫保护性分析．以160EU剂量对2～3月龄婴猴进行0,4周免疫后,动物在第4周接受了剂量为10。～CCID50的病毒经呼吸道的攻击．对病毒攻击后动物在14天内的临床症状、血液生物学、器官病原学分布以及病理学检测的动态观察表明,经疫苗免疫的动物未出现对照动物所具有的特征性临床表现,其血液生物学及病理学检测均无异常．同时,器官病原学分布亦呈阴性．结合动物中和抗体的明确增长及对照动物的综合表现分析,本文的工作证实了该EV71灭活病毒疫苗（人二倍体细胞）在恒河猴婴猴体内的免疫保护性．     

抗HSV-IICP22蛋白抗原多肽抗体对ICP22定位的检测分析

ICP22作为单纯疱疹病毒进入细胞后最早表达的蛋白之一,对于病毒的复制具有重要的调节功能,由于抗原表位的同源性,使用完整的ICP22蛋白作为抗原难以获得特异性的抗体.通过氨基酸序列预测,ICP22蛋白1～36位氨基酸具有较强的抗原性,将ICP22蛋白1-36位氨基酸偶联于GTS蛋白作为抗原免疫小鼠,所制备抗体能够特异性识别具有正常生理构象的ICP22蛋白.抗体检测结果显示,ICP22不但定位于细胞核内,而且还能够形成特殊的点状结构.     

SARS病毒免疫学性状的结构基础分析

运用生物信息学技术,对SARS冠状病毒基因组及其编码区进行了全序列分析,根据其基因和推导蛋白结构特点及同源性分析,探索SARS病毒主要结构蛋白免疫学性状的结构基础及进一步进行免疫学研究的线索,为深入SARS病毒的诊断预防工作提供参考 。     

利用恒河婴猴模型对肠道病毒71型传播感染特征的生物学分析

本文在前期工作基础上,进一步对肠道病毒71型(EV71)从恒河婴猴的感染个体向其他未感染个体传播的可能性及相关生物学特性做了初步分析.通过喷雾形式经呼吸道感染1~2月龄恒河婴猴(A组);在观察临床症状同时,于感染后第7天,取该组动物粪便处理后,将上清液以喷雾形式经呼吸道感染新的婴猴个体(B组),随后对该次代感染个体进行...     

不同饲养密度对亮斑扁角水虻幼虫生长发育及新鲜牛粪转化率的影响

为了解决养牛业中粪便污染问题,本研究利用亮斑扁角水虻(黑水虻)来转化利用牛粪,探讨了饲养密度对新鲜牛粪的转化效率。本试验以亮斑扁角水虻为研究对象,选择设置每20.0 kg牛粪投入3500头、8750头、17500头4日龄幼虫3个处理密度,在每个密度日均1.0 kg等量饲喂条件下,分析亮斑扁角水虻幼虫百虫重、粗蛋白、粗脂肪、牛粪转化率指标的差异,探索一种适于亮斑扁角水虻幼虫处理新鲜牛粪的饲养密度。结果表明:百虫重、粗蛋白、粗脂肪3个指标在3组处理之间都存在极显著差异。百虫重和粗脂肪两个指标和试验组密度情况在0.01的水平上显著负相关,但3个处理中转化率最高的为8750头的饲养密度。综合评价认为亮斑扁角水虻4日龄幼虫8750头/20.0 kg牛粪的投入量为实验范围内最佳饲养密度。     

添加保护剂促进碱性果胶酶的工业保藏稳定性

保藏稳定性对于商品酶具有重要的实际意义。通过对碱性果胶酶的保护剂进行研究,最终筛选得到最优复合保护剂配方为：Tween201mL／L,六偏磷酸钠1．5g／L,明胶5g／L,甘油5％（口～）,CaCl22g／L;热稳定性提高18倍。此外在常温保藏时,在酶液中添加0．3‰山梨酸钾和0．3‰苯甲酸钠,能有效提高保藏效果,减少酶液染茵、混浊和发臭,最终常温保藏90d后酶活保留率为84．5％,达到工业化保藏的要求。     

Red同源重组敲除nagE和manX对大肠杆菌发酵生产氨基葡萄糖的影响?

氨基葡萄糖(GlcN)又称氨基葡糖或葡糖胺,是葡萄糖的一个羟基被氨基取代后的化合物,在医药和保健领域具有广泛应用。在前期研究中,我们构建了一株可高效合成GlcN和其乙酰化衍生物N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)的重组大肠肝菌Escherichia coli-glms-gna1(在下游提取过程中用弱酸进行脱乙酰化即可将GlcNAc转化为GlcN)。但研究发现,发酵过程中GlcN和GlcNAc能被转运至胞内作为碳源利用,导致胞外产量显著减少。为阻断胞外GlcN和GlcNAc向胞内的转运,利用Red同源重组技术将E.coli-glms-gna1的乙酰氨基葡萄糖磷酸转运子编码基因nagE和甘露糖磷酸转运子编码基因manX敲除,获得nagE基因敲除的工程菌E.coli-glms-gna1-nagE和nagE/manX基因双敲除的工程菌E.coli-glms-gna1-nagE-manX,并在7 L发酵罐上利用构建的工程菌进行GlcN和GlcNAc的发酵生产。实验结果表明:培养对照菌株E.coli-glms-gna1至12 h时GlcN产量达到最大值4.06 g/L,GlcNAc产量达到最大值41.46 g/L;而培养单基因敲除菌株E.coli-glms-gna1-nagE至12 h时GlcN产量达到最大值4.38 g/L(是对照菌株的1.08倍),GlcNAc产量达到最大值71.80 g/L(是对照菌株的1.7倍);培养双基因敲除菌株E.coli-glms-gna1-nagE-manX至10 h时GlcN产量达到最大值4.82 g/L(是对照菌株的1.2倍),GlcNAc产量达到最大值118.78 g/L(是对照菌株的2.86倍)。这表明nagE和manX基因的敲除可显著降低GlcN和GlcNAc向胞内的转运,进而提高其在胞外的积累。研究结果对最终实现GlcN的工业化生产具有一定的指导意义。