中国1995～1999年鸡传染性支气管炎病毒地方分离株核蛋白基因的遗传变异分析

应用RT-PCR方法扩增到了我国1995~1999年10株IBV现地分离株的核蛋白基因片段,并将其进行了克隆、序列测定及分析。结果发现,10株IBV分离株核蛋白基因均含有一个长1 230bp的ORF,编码由409个氨基酸残基组成的多肽,未发现碱基的插入和缺失。与GenBank中的20个IBV参考毒株核蛋白基因序列进行比较和分析,发现本研究分离的毒株主要分布于3个群中,该3群病毒主要包括我国IBV现地分离株。对n基因及其局部功能区序列比较发现,我国分离株与H120疫苗株N蛋白存在广泛的氨基酸变异。通过与s1基因系统发育进化树比较发现,我国IBV分离株存在基因重组现象。以上结果表明我国1995~1999年IBV毒株存在基因突变和基因重组现象。     

猪传染性胃肠炎病毒n基因的原核表达及重组蛋白的免疫活性分析

猪传染性胃肠炎(transmissible gastroenteritis,TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gas-troenteritis virus,TGEV)引起的一种急性、高度接触性传染病,以呕吐、水样腹泻、脱水和对2周龄以内仔猪高度致死率为特征[1]。猪传染性胃肠炎病毒隶属于冠状病毒科冠状病毒属,是引起仔猪病毒性腹泻的重要病原,其基因组为单股正链的有感染性不分节段的RNA,TGEV结构蛋白主要由S、N、Ms、M蛋白组成[2]。其中n基因指导合成病毒的核衣壳蛋白(N),它是一种磷酸化的蛋白,存在于病毒粒子的内部,其分子质量为47kD[3],与病毒基因组组成核衣壳;N…     

鹅细小病毒vp基因片段的原核表达及抗血清的制备

以鹅细小病毒(Gooseparvovirus,GPV)HG5/82株基因组作为PCR反应模板,扩增vp基因3’端长864bp的基因片段,将其克隆到pMD18-TSimple克隆载体后转化入大肠杆菌TG1。筛选阳性质粒,并通过BamHⅠ和HindⅢ将外源基因定向克隆到原核表达载体pET-30a,阳性重组质粒经确证性序列测定,证明外源片断插入到pET-30a的预期位置。将其转入大肠杆菌BL21,经终浓度为0.6mmol/L的IPTG诱导,SDS-PAGE表明外源基因获得表达,融合蛋白分子量约为34kDa。将诱导后的工程菌用6mol/L盐酸胍裂解,经超声处理后离心,利用镍离子亲和树脂对裂解产物的上清进行纯化。用纯化的融合蛋白免疫新西兰白兔制备兔抗该融合蛋白的抗血清。Westernblotting结果表明制备的兔抗血清与该融合蛋白及亲本病毒的结构蛋白都具有反应性。结合前期工作进展对GPVVP蛋白的B细胞线性抗原表位进行定位。     

鸡传染性支气管炎病毒CK／CH／LDL97 Ⅰ／97株S基因特征

鸡传染性支气管炎(Infectious bronchitis,IB)是由传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)引起的一种急性高度接触性传染病。该病主要侵害鸡的呼吸系统、消化系统和泌尿生殖系统,可引起雏鸡死亡,蛋鸡产蛋量和蛋品质下降,给养禽业造成很大的经济损失,成为影响世界各国养禽业发展的主要疫病之一。IBV是尼多病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)第三群的典型代表种[1]。其基因组为不分节段的单股正链RNA,全长约27.6kb[2]。IBV S蛋白形成病毒表面的纤突结构,翻译后的前体蛋白在跨膜时被…     

鸡传染性支气管炎病毒E蛋白基因的表达

鸡传染性支气管炎(Infectious Bronchitis,IB)是由传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus,IBV)引起的鸡的一种急性、高度接触性传染病。该病是危害全球养禽业的重要传染病之一[1,2]。其感染的主要特征是气管啰音、咳嗽和打喷嚏?送猓?该病还可以引起蛋鸡产蛋量下降和蛋品质下降。雏鸡可由于呼吸道或肾脏的感染而死亡。虽然疫苗的使用对IB的流行起到了一定的预防和控制作用,但由于IBV血清型众多,不同血清型毒株之间具有较小的交叉保护性甚至无交叉保护性。因此,IB目前仍在免疫鸡群和非免疫鸡群发生和传播,给养禽业造成了严重…     

鸽β-防御素5基因克隆及其抗菌活性

从鸽的骨髓和肝组织中扩增到2个禽β-防御素(AvBD)基因,在大肠杆菌中高效表达,检测其重组蛋白的抗菌活性。应用RT-PCR方法从鸽的骨髓和肝脏组织中扩增AvBD5基因,根据已发现的禽β-防御素和部分哺乳类动物β-防御素-5的氨基酸序列构建系统进化树,将该基因克隆到大肠杆菌原核表达载体pGEX-6p-1上进行原核表达,对该重组蛋白进行纯化,测定体外抗菌活性与理化特性。测序得到这2个基因的cDNA大小均为201 bp,编码66个氨基酸残基,内含6个位置保守的半胱氨酸残基。经遗传进化分析发现,该基因推导的两组氨基酸序列与鸭AvBD5的同源性最高,分别为87.9%和78.8%,这两组氨基酸序列的同源性为83.3%。因此,将其分别命名为鸽AvBD5α(骨髓)和鸽AvBD5β(肝脏)。进一步将这两个基因分别亚克隆到大肠杆菌pGEX-6p-1载体中进行原核表达。两个重组融合蛋白经纯化后,通过菌落计数法测定其体外抗菌活性,盐离子浓度对其抗菌活性的影响,及其融合蛋白的溶血活性。结果表明,重组鸽AvBD 5α、AvBD 5β融合蛋白的分子量约为32 kDa。具有明显的抗菌活性,对12种细菌均有不同程度的抑制作用,高盐浓度对其抗菌活性显著影响。此外,这两个重组蛋白对红细胞无显著溶血活性。     

猪轮状病毒vp4基因的克隆及其在昆虫细胞中的表达

本研究扩增猪轮状病毒中国分离株JL94株VP4蛋白主要抗原编码区基因(1-756bp),将测序结果与国外分离株进行比较;将该基因片段同载体pMel BacA连接后,与杆状病毒DNA共转染入昆虫细胞Sf9,经蚀斑筛选纯化重组病毒并再感染Sf9细胞获得vp4基因的表达,对表达的VP4蛋白进行Western blot分析和血清中和抗体试验。结果表明：JL94株VP4主要抗原编码区基因与国外分离株CRW-8株、Gottfried株该基因片段氨基酸同源性分别为96．43％和67％,说明JL94株与CRW-8株属同一VP4血清型,而与Gottfried株属不同血清型。JL94株vP4主要抗原编码区氨基酸最大变异处位于aa81-aa207。vp4基因在昆虫细胞中表达量占细胞总蛋白的20％,Western Blot证实表达蛋白有良好的生物学活性。所表达的蛋白免疫小鼠产生中和抗体,阻断JL94在MA104细胞上引起的细胞病变。     

鹅细小病毒分离株HG5／82的分子特征分析

本研究应用PCR技术扩增得到GPV中国分离株HG5/82的非结构基因与结构基因,片段大小分别约为1.9kb、2.2kb的片段。将该片段分别进行克隆及序列测定,并与 GPV 国内外部分已发表的毒株及番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus,MDPV)的对应序列比较。结果表明:HG5/82 株非结构蛋白(Non structure, NS)基因长为1884bp,编码627个氨基酸。HG5/82株结构蛋白基因长为2199bp,编码732个氨基酸。序列分析结果表明,我国地方分离株与国内外鹅细小病毒相比,ns基因、vp基因均表现出较高的同源性,并且具有共同的分子特征。为进一步研究GPV的基因功能、遗传变化规律及病毒分子致病机理提供了一定的分子基础。结构基因 VP3 间变异较小,这是目前GPV只有一个血清型的分子基础,为基因工程苗的研制提供了可行性。HG5/82 与番鸭细小病毒相应序列比较发现,与细小病毒其它成员相比两者具有较近的亲源关系,但这种同源性明显低于鹅细小病毒之间的同源性。     

饲喂重组鸡白细胞介素18蛋白增加肉仔鸡体重的初步研究

经口服途径给肉仔鸡饲喂重组鸡白细胞介素 1 8(ChIL -1 8)蛋白,观察其在正常饲养条件下和人工感染鸡传染性支气管炎病毒 (IBV)时对肉仔鸡的影响。将 84只肉仔鸡随机分为 2组:正常称重组和IBV接种组。 2组肉仔鸡再随机各分为 3个亚组,分别每隔 5d各口服 1次PBS、细菌蛋白和重组ChIL -1 8蛋白。正常称重组每亚组 8只,每次口服前称重。IBV接种试验组每亚组 2 0只,在 30日龄时滴鼻接种IBVM41株并每隔 5d称重 1次。各亚组试验鸡分别在正压隔离器中饲养。结果表明,饲喂重组ChIL- 1 8蛋白的试验亚组肉仔鸡体重总增重量明显高于饲喂PBS和细菌蛋白的对照亚组;IBV接种试验组肉仔鸡在人工感染IBVM41株后,饲喂重组ChIL 1 8亚组的发病率和死亡率明显低于饲喂PBS和细菌蛋白亚组,而且后 2个亚组肉仔鸡临床症状也较饲喂重组ChIL- 1 8试验亚组明显。结果初步显示,饲喂重组ChIL -1 8融合蛋白能够增加肉仔鸡体重并可增强肉仔鸡对IBV感染的抵抗能力。