框内缺失突变法构建变形链球菌comE基因突变株

变形链球菌的种内密度感应系统由com基因家族编码控制。膜受体ComD接受密度感应信号后激活菌体内的反应调节子ComE,ComE作为启动子可以调节一系列相关基因的表达。应用框内缺失突变法（in-frame deletion）,通过两次同源性重组,成功构建了变形链球菌comE基因突变株IFD140ΔcomE。由于框内缺失突变没有引入任何的遗传标记物,所以有效地避免了传统的基因失活方法——插入重复(insertion duplication) 和等位交换(allelic exchange),所导致的下游基因极性效应（polar effect）。经过PCR、测序分析及RT-PCR,证实IFD140ΔcomE仅在comE基因内部缺失了717bp的片段,未引入任何外源性DNA,且comE下游的comD基因可以正常转录,无极性效应产生。对IFD140Δcom表型特征的研究发现,在液体培养基中IFD140Δcom更易发生沉淀性生长和贴壁性生长。菌体呈长链状排列。IFD140ΔcomE的成功构建,为进一步研究变形链球菌种内密度感应系统奠定基础。     

变形链球菌反应调控蛋白ComE结合序列的初步筛选

目的：从变形链球菌基因组中筛选反应调控蛋白ComE结合的核酸序列。方法：⑴提取变形链球菌UA159 基因组,进行超声剪切处理。以基因组片段为模板,用随机引物进行延伸,切胶纯化和PCR 扩增后获得基因组文库。⑵应用基因组 SELEX 技术,以ComE 蛋白为靶物质,与变形链球菌基因组文库共同孵育,循环筛选8轮。筛选产物TA克隆后送去测序,测序结果进行生物信息学分析。⑶将分析得到的2个序列分别克隆入pFW5-luc载体中,然后分别重组到变形链球菌UA159野生株和comE突变株的基因组中,采用RT-PCR的方法检测luc片段的表达。结果：⑴获得了变形链球菌UA159 的基因组文库,片段范围约为100～300bp。⑵随机挑取54个克隆送去测序,经生物信息学分析和RT-PCR初步验证,最终获得1个ComE 蛋白可能的结合序列。结论：采用基因组 SELEX 技术,筛选反应调控蛋白ComE可能的结合序列,并进行了初步验证,为后续进行变形链球菌反应调控蛋白ComE调控机制的研究奠定了基础。