H9N2禽流感病毒反向遗传系统转录／表达载体的构建和验证

设计带有BsmBI、BsaI或AarI酶切位点的引物,用RT-PCR扩增H9N2亚型禽流感病毒(AIV)的8个基因全长片段,克隆入双向转录/表达载体pHW2000,并在PB2、PB1和NA基因中共引入了3个沉默突变标签。将其2个表面基因(HA和NA基因)加上任意1个内部基因,而其它5个内部基因来自A/WSN/33,进行了6种3 5组合形式的基因重排,把相应组合的转录/表达质粒共转染COS-1细胞,均产生了预期组合、有感染性的H9N2亚型流感病毒,表明亲缘关系遥远的流感病毒可以互相获取基因片段产生重组病毒,提示表面结构基因和单个内部基因不足以限制H9N2AIV在哺乳动物细胞上的宿主范围,同时也验证了构建的8个转录/表达载体均能有效工作,为进一步研究H9N2亚型AIV基因结构与功能、AIV与宿主之间的关系打下了基础。     

抑制差减杂交筛选禽致病性大肠杆菌基因组差异片段及其分析

采用抑制差减杂交技术(Suppression subtractive hybridization,SSH)对禽致病性大肠杆菌E037株(血清型O78)与非致病菌株K-12MG1655以及同一O2血清型高致病菌株E058与低致病菌株E526进行基因组差异片段克隆与分析。从E037株中共检出17个特异性差异片段,E058株中共检出32个特异性差异片段。经同源分析,这些序列可分为4类:质粒相关序列、噬菌体相关序列、已知功能序列、未知功能序列。这些差异片段包含许多重要的大肠杆菌毒力相关基因,如大肠杆菌素、气杆菌素受体、铁基因簇等。49个片段中,14个片段与其它微生物基因组同源性较高。结果表明,大肠杆菌高致病株与低致病菌株或非致病菌株基因组间存在较多差异基因,其中包括毒力、毒力相关基因、代谢以及噬菌体等基因成分。     

鼠伤寒沙门氏菌SL7207 SifA-突变株的构建和鉴定

鼠伤寒沙门氏菌SifA^-基因突变株的特点是能进入真核细胞的胞液。利用P22噬菌体转导技术构建了鼠伤寒沙门氏菌疫苗株SL7207的SifA^-突变株SL7207,该突变株与SL7207有着相似的体外生长曲线和细胞侵袭力,SL7207。在MDCK上皮细胞中的增殖能力增强,但在RAW264．7巨噬细胞中的生存能力减弱。小鼠毒力试验显示SL7207。在BALB／c小鼠体内毒力下降。仅SL7207在体外可向RAW264．7巨噬细胞递送真核表达质粒。SL7207的构建为重组沙门氏菌疫苗载体的研制提供了一个新的选择。     

鸡痘病毒复制非必需区的选择对重组鸡痘病毒免疫效力的影响

母源抗体的干扰是重组鸡痘病毒(FPV)活载体疫苗至今未能得到大规模推广应用的主要原因,而选择适当的FPV复制非必需区可能是解决这一问题的方法之一。根据已发表的美国致病株FPV的基因组设计两对引物,用PCR方法扩增FPV假定复制非必需区的两个侧翼区FPV1和FPV2 ,利用此假定复制非必需区构建FPV表达载体pP12LS及表达ZJ1株新城疫病毒(NDV)F基因的转移载体pP12LSF。pP12LSF与2 82E4株FPV共转染鸡胚成纤维细胞(CEF) ,经数轮蓝斑筛选得到纯化的重组病毒rFPV_FSC。重组FPV在CEF上连续传2 0代仍具有良好的遗传稳定性。对重组FPV进行免疫效力试验,在SPF鸡上,重组病毒rFPV_FSC和与之仅有复制非必需区差异的rFPV_FSB均能抵抗NDV强毒的攻击,提供10 0 %的保护。但在有母源抗体的商品鸡上,rFPV_FSC与rFPV_FSB的免疫效力却有显著差异,保护率分别为10 0 %和6 1 5 4 % ,rFPV_FSC的免疫效力与NDV常规油苗相当。试验结果表明,母源抗体对重组FPV的免疫效力有一定的影响,而选择合适的FPV复制非必需区是克服母源抗体并提高重组FPV免疫效力的有效策略之一     

共表达H5亚型禽流感病毒HA和NA基因的重组鸡痘病毒及其免疫效力

为了构建更为安全有效地抵抗高致病性H5亚型禽流感病毒的基因工程疫苗,将H5亚型禽流感病毒分离株的血凝素(HA)基因和神经氨酸酶(NA)基因定向插入鸡痘病毒转移载体p11S中,H5A和NA基因的启动子分别为PS和PE/L,获得用不同的启动子启动不同的外源基因且两基因盒方向为背向串联的重组转移载体p11SH5ANA。将p11SH5ANA转染至已感染鸡痘病毒282E4疫苗株(wt-FPV)的鸡胚成纤维细胞(CEF)中。p11SH5ANA与wt-FPV基因组DNA之间的同源重组产生了重组鸡痘病毒rFPV-11SH5ANA。通过在含X-Gal的营养琼脂上连续挑选蓝色病毒蚀斑,获得纯化的重组病毒。经传代证实该重组病毒具有良好的遗传稳定性。用105PFU的rFPV-11SH5NA免疫无特定病原体(SPF)鸡,能激发机体产生有效的血凝抑制(HI)抗体。初步的动物试验表明,该重组病毒能使经肌肉注射攻毒的SPF鸡抵抗H5亚型AIV的致死性攻击,保护率为100%,显示出一定的应用前景。     

利用反向遗传技术研究H9N2亚型AIV传播途径的分子机制

利用反向遗传技术,通过基因重排方法,产生两个表面基因来自A/Chicken/Guangdong/SS/94(H9N2)禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)株和其余基因来自A/Chicken/Shanghai/F/98(H9N2)AIV株的3株H9N2亚型重排AIV,动物传播性试验发现A/Chicken/Shanghai/F/98(H9N2)株、A/Chicken/Guangdong/SS/94(H9N2)AIV株和3株H9N2亚型重排AIV都可以经直接接触途径传播;在粪便接触途径下,3株重排AIV都不经粪便接触传播;只有A/Chicken/Shanghai/F/98(H9N2)株和重排AIV RF7/SSHA能经过气溶胶途径传播。HI试验结果进一步证明了以上的结果。实验结果表明H9N2亚型AIV的NA基因与H9N2亚型AIV气溶胶传播途径有重要的关系,即1998年中国大陆H9N2亚型AIV大流行可能是因为病毒获得气溶胶传播途径的特性,推测病毒的NA基因发挥了重要作用。     

新城疫病毒基质蛋白与禽细胞核磷蛋白B23.1在HEK-293T细胞中的相互作用

【目的】探讨新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）基质（matrix,M）蛋白和禽细胞核磷蛋白B23.1在HEK-293T细胞中的相互作用。【方法】分别参照GenBank中NDV JS/5/05/Go株全基因序列（JN631747）和禽细胞核磷蛋白B23.1基因序列（NM₂05267）,设计、合成扩增M基因和B23.1基因的引物,利用RT-PCR扩增出M基因和DF1细胞的B23.1基因,分别克隆至真核表达载体获得重组表达质粒pEGFP-M、pCMV-HA-M和pDsRed-B23.1;将pEGFP-M和pDsRed-B23.1共转染HEK-293T细胞,利用荧光显微镜观察M蛋白与B23.1蛋白的共定位;利用免疫共沉淀（Co-IP）技术进一步验证两种蛋白的相互作用。【结果】Western blot结果表明构建的重组质粒在转染的HEK-293T细胞中正确表达;荧光显微镜观察显示M蛋白与B23.1蛋白在核仁具有共定位特征;Co-IP进一步证实两者能发生相互作用。【结论】NDV M蛋白与禽细胞核磷蛋白B23.1存在相互作用,M蛋白可能通过与B23.1蛋白的相互作用进入核仁。     

H5N1亚型禽流感病毒HA糖基化位点缺失突变株的构建及生物学特性

不同H5亚型禽流感(AIV)HA上糖基化位点的分布是不同的,然而不同糖基化位点对病毒的作用仍不十分清楚。本研究利用定点突变和反向遗传操作构建了3个不同糖基化位点单缺失突变病毒,并对其增殖特性和毒力进行了测定。结果表明,通过HA基因序列测定和免疫印迹分析证实已成功去除了特定糖基化位点。158位糖基化位点缺失突变株rS△158在鸡胚中的EID50和MDCK细胞上TCID50比野生型rS略低,空斑直径显著减小;而单独去除169位和290位糖基化位点的rS△169和rS△290的EID50和TCID50略高于野生型rS,空斑直径相近,但空斑数要比后者高出10倍以上。所有突变株及野生型病毒在CEF上增殖速率相同,对SPF鸡均是高致病性的。因此,糖基化位点可影响病毒的体外增殖,但结果因细胞而异。     

北京市六环内城市森林结构总体特征

城市森林结构决定了城市森林的外貌、总体绿量,影响其生态效益.本文对北京市六环外1 km范围内城市森林分层抽样调查,研究其多样性及乔木规格,并根据北京城市特点分析其空间差异,以期找出存在问题及梯度变化规律,为北京城市森林多样性保护及科学管理提供依据.通过对各类城市森林847个标准样方的调查,共记录木本植物50科、106属、159种,本地种占75%;城市森林植物群落仍然是少数物种主导,毛白杨(Populus tomentosa Carr.)与国槐(Sophora japonicaL.)分别为使用数量最多(9.7%)和使用频度最高(28.45%)的树种;乔木平均胸径19.79 cm,平均冠幅5.4 m,规格总体偏小,且规格差异不大.北京市城市森林沿城市发展方向由城内向城外展现出了明显的梯度变化:总物种数4环外多于4环内,最高为4~5环112种;多样性指数逐渐降低;乔木规格减小;“城六区”物种组成、多样性及乔木规格均优于其他行政区.     

CT灌注成像在兔早期肝硬化诊断中的应用价值研究

目的:探讨CT灌注成像在兔早期肝硬化诊断中的应用价值。方法:将55只新西兰大白兔随机分为2组,其中实验组45只,对照组10只。实验组给予皮下注射葡萄籽油稀释的50%CCL4,1次/4天,前4次剂量为1.0 m L/kg,第5次剂量为1.35 m L/kg,共注射20次。对照组采用同样方法只注射相同剂量的生理盐水。每注射4次后分别对实验组兔7只和正常对照组兔2只做螺旋CT灌注扫描,分析灌注参数,同时做相应的病理学观察,将二者进行比较及统计学分析。结果:注药4次末,兔血清ALT及AST明显高于注药前,注药8次末,兔血清ALT及AST最高,之后兔血清ALT及AST轻度减低,注药前后兔血清ALT及AST的变化有统计学意义(P0.05)。而血清(ALB)水平变化不明显,仅在注药16次末后,ALB水平稍减低,但差异无统计学意义。对照组肝脏灌注参数正常,实验组从注药4次开始,HAP呈上升趋势,但注药4次末及注药8次末,实验组及对照组之间差异无统计学意义(P0.1),注药12次末后二者之间差异有统计学意义(P0.05);而HPP、HBF及HBV呈下降趋势,MTT逐渐延长,与对照组的差异均有统计学意义(P0.05)。随兔血清ALT及AST的升高,HAP逐渐升高,MTT逐渐延长,而HPP、HBF及HBV逐渐减低。实验组肝小叶正常结构破坏,肝实质被纤维组织分割成大小不一、圆形或近圆形结节(假小叶),间隔较窄,炎症轻,结节边界尚整齐;汇管区内门脉小支扩张,壁增厚。对照组肝小叶结构规整,肝板排列有序,汇管区无扩大,其内个别炎细胞浸润,肝小叶内偶见点灶状坏死。结论:全肝CT灌注功能成像可为早期肝硬化的诊断提供影像学依据,将灌注征象与病理学变化结合有利于肝硬化的早期诊断和治疗。