转油菜素内酯合成基因DET2烟草对NaCI胁迫的反应

通过农杆菌介导法,将含有油菜素内酯合成基因DET2的植物表达栽体pCAMBIA2301-DET2转入烟草,获得转基因烟草植株.用T1代转基因阳性株进行耐NaCl试验,结果显示,NaCl胁迫下转基因烟草、非转基因对照烟草的出苗率、幼苗鲜重、株高及根长均随NaCl浓度增加而下降.但在相同NaCl浓度下,转基因植株鲜重、株高及根长均明显高于非转基因对照烟草,并且转基因植株的丙二醛( MDA)含量低于非转基因植株,诱导蛋白基因P5CS表达高峰出现时间晚于非转基因植株.说明DET2的表达提高了烟草的耐NaCl能力.     

琉璃苣BoD6D载体的构建及转化

运用植物基因工程手段构建琉璃苣BoD6D转化载体,为提高油料作物油份中γ-亚麻酸含量奠定基础。以琉璃苣基因组DNA为模板克隆BoD6D,构建酵母表达载体并转化酿酒酵母,对酵母进行诱导表达,提取脂肪酸后进行甲酯化反应,利用气相色谱分析脂肪酸含量;同时构建植物双元表达载体,经农杆菌介导通过蘸花法转化拟南芥,最后对转基因拟南芥通过抗性筛选及PCR进行鉴定。结果表明,BoD6D编码区不含有内含子,可以直接用于后续的功能研究;成功构建了酿酒酵母表达载体pYES2-BoD6D,气相色谱检测结果表明BoD6D在酵母中能够成功的将亚油酸催化生成γ-亚麻酸;成功构建了植物双元表达载体pBI121-BoD6D,卡那霉素抗性筛选和PCR鉴定结果表明已经成功获得BoD6D的拟南芥转化植株。通过以琉璃苣基因组DNA为模板比较方便的获得有功能的BoD6D用于转基因植物研究。     

甜叶菊葡糖基转移酶基因UGT76G2的克隆及生物信息学分析

本研究利用RT-PCR方法从甜叶菊(Stevia rebaudian)叶片中分离了与甜叶菊UGT76G1高度同源的UGT76G2基因,该基因编码一条分子量为52.029 kD的由458个氨基酸残基组成的多肽,含有c-端所特有的高度保守的信号序列PSPG基序和N-端膜结合序列,属于植物中特有PSPG基序的UGT家族成员.半定量RT-PCR分析表明:UGT76G2在甜叶菊根、茎、叶、花不同组织中具有组织表达特异性,在叶组织中的表达丰度略高,在根中不表达而在茎中表达较低.推断的UGT76G2编码产物与其它参与植物次级代谢产物的糖基转移相关酶同源比对和系统发生分析表明该蛋白与康乃馨(Dianthus caryophyllus)DicGT4、棉花(Gossypi-um hirsutum)GhUGT1、甜叶菊(Stevia rebaudian)UGT76H1及玉米(Zea mays)BX8的一致性较高,分别为41%、35%、35%和32%.对UGT76G2和UGT76G1的次级结构和立体结构分析发现,苜蓿(Medicago sativa)UGT71G1与二者的一致性皆为23%,它们有类似的次级结构.在C-端的PSPG信号区内具有10个相同的基质结合位点.但在UGT76G2和UGT76G1之间也有个别位置氨基酸存在差异.它们的N-端含有保守的组氨酸H25和天冬氨酸D124残基,可能与受体的结合有关.     

对羟基苯甲酸和间苯三酚对棉花幼苗根系线粒体功能和根系生长的影响

以中国大面积种植的早熟棉中棉所50(CCRI-50)为材料,设置水培试验,研究不同浓度(0.8、4.0、20.0 mmol·L^-1)的对羟基苯甲酸和间苯三酚对棉花苗期根系线粒体活性氧产生、抗氧化酶活性变化及线粒体特性的影响.结果表明: 对羟基苯甲酸和间苯三酚抑制了棉花根系生长,降低了根系线粒体超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)和线粒体膜H⁺-ATPase活性,增加了O₂^-·产生速率和H₂O₂含量;对羟基苯甲酸和间苯三酚处理还增大了线粒体细胞通透性转换孔(MPTP)开放程度,降低了线粒体膜流动性和细胞色素Cyt c/a 值.0.8 mmol·L^<sup>-1的对羟基苯甲酸和间苯三酚处理间线粒体功能差异相对较小,4.0和20.0 mmol·L^-1时,对羟基苯甲酸处理对根系生长和线粒体功能的抑制作用高于间苯三酚处理.总之,对羟基苯甲酸和间苯三酚均抑制了棉苗根系生长和线粒体功能,且浓度越高,抑制作用越强.对羟基苯甲酸和间苯三酚处理间存在差异,浓度高于4.0 mmol·L^-1时,对羟基苯甲酸比间苯三酚具有更强的抑制作用.     

细菌的氧化应激及基因表达调控

细菌受到氧化胁迫时,在细胞内形成氧化伤害并作为一种生理信号激活特定的调控子,诱导某些具有抗氧化作用的蛋白质从而保护自身.其中最为重要的是两种氧化还原应答转录因子SoxR和OxyR调控子.前者是MerR家族成员,含有铁硫中心,在细胞内以二聚体的形式存在,在感受到氧化剂刺激后激活SoxS基因的表达,形成SoxRS调控子,从而激活一系列抗氧化基因的表达;后者是LysR蛋白家族成员,在细胞内以四聚体的形式存在,舍有一对半胱胺酸残基,能被H2O2氧化形成二硫键,激活下游基因的表达.     

PQR转运体基因赋予大肠杆菌BL21百草枯抗性

前期研究中成功地分离了2个对百草枯具有高度抗性的土壤细菌SPQ03和SPQ14.本研究从这两个菌分别克隆了基因PnPQR和OaPQR,二者ORF全长均为1 233 bp,编码410个氨基酸残基,含有11个跨膜区(TMS),属于非典型的主要易化超家族(major facilitator superfamily, MFS).立体结构分析表明,蛋白的N端和C端分别由5个和6个由α-螺旋组成的跨膜区.只有P151L和P154V两个氨基酸不同.将两个基因在大肠杆菌BL21菌株中异源表达,能提高大肠杆菌对百草枯的抗性,但不能提高其对过氧化氢的抗性.     

棉花GhZIP4基因的克隆及表达分析

根据EST拼接的序列设计引物,利用RT-PCR和PCR方法,从陆地棉‘苏棉18’-cDNA和基因组DNA中分别克隆获得了GhZIP4基因片段.结果表明:(1)GhZIP4基因cDNA序列全长1 487 bp,包含1 269 bp ORF,编码422个氨基酸残基,其氨基酸序列具有典型的ZIP蛋白特征,预测具有8个跨膜结构域,第Ⅲ和第Ⅳ跨膜结构域间存在可变区,在可变区有2个富含His的结构域“HRHSHPHG”和“HSHGHGHD”.(2)氨基酸进化树分析显示,GhZIP4同拟南芥ZIP家族AtZIP4的相似性较高.(3)GhZIP4 DNA序列编码区全长1 778 bp,包含4个外显子和3个内含子,所有外显子/内含子交接点都遵从gt/ag剪接规则.(4)半定量分析显示,GhZIP4基因在茎中表达量最高,表明该基因有可能在某些金属离子地上部和根部的动态平衡分布过程中具有重要作用.     

陆地棉SUPERMAN类似锌指蛋白基因的克隆与表达分析

锌指蛋白是生物体内数量最多的转录调控因子,它在动植物的生长发育中都起到十分重要的作用。SUPERMAN类锌指蛋白只含有1个锌指结构。我们根据这类蛋白的保守结构域设计简并引物,通过RT-PCR从棉花中获得了3个这个家族成员的EST,得到1个锌指蛋白基因的全长序列,该基因的编码区长744 bp,编码长248个氨基酸的多肽,其氨基酸序列与GenBank中登录的一个拟南芥RBE蛋白有40%的同源性。此基因被命名为GZFP。它含有保守的锌指结构并在多肽链的C-端具有富含亮氨酸的保守结构域,GZFP含有核定位信号并且没有内含子。GZFP基因在棉花花蕾、子房、花瓣和根中的表达量要高于木质部、韧皮部、叶片、纤维和种子。GZFP基因的表达量很低,在GenBank中没有任何和它同源的EST序列存在。对GZFP 5′侧翼区进行分析发现有数个花粉和根特异表达相关元件,4个与Dof蛋白作用的核心序列,4个与光诱导相关的元件。      

植物莽草酸途径EPSPS蛋白的分子进化和基因结构分析

EPSPS既是植物、微生物和真菌等生物芳香族氨基酸生物合成途径——莽草酸途径中的关键酶,也是除草剂草甘膦的靶标酶。EPSPS的克隆能为草甘膦抗性转基因作物的研发提供候选基因。该研究运用比较基因组学方法,通过对41种不同植物的43条EPSPS蛋白序列进行进化分析,取得主要结果如下:(1)不同植物EPSPS蛋白的相似性很高,且具有相同的结构域、保守基序和保守位点,但是其叶绿体转运肽序列差异显著;(2)系统发育分析表明,EPSPS基因按照双子叶植物纲和单子叶植物纲分为2个大的分支,各个小的分支又按照植物的种属亲缘关系进行分支和聚类;(3)基因结构分析表明,植物EPSPS基因基本都含有8个外显子和7个内含子,且所对应外显子的长度相当,而内含子的长度差异很大,说明在植物基因组进化过程中造成EPSPS基因结构差异的主要因素是内含子的改变。研究结果将为揭示植物EPSPS蛋白的结构功能提供参考。