家蝇变应原Tropomyosin基因的克隆、序列分析及诱导表达

对家蝇变应原原肌球蛋白(Tropomyosin)基因进行同源克隆,序列分析;构建原核表达载体并在大肠杆菌中表达。从家蝇幼虫cDNA文库中筛选获得Tropomyosin基因。以该基因的cDNA文库质粒为模板,进行PCR扩增,获得家蝇Tropomyosin完整编码序列。运用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白的基本理化性质、信号肽、二级结构、三级结构、抗原表位和亚细胞定位等方面进行预测和分析。构建pEASY-E1-Tropomyosin重组质粒,转化到大肠杆菌OrigamiB(DE3)中进行诱导表达。Tropomyosin基因ORF全长828 bp,编码275个氨基酸,理论分子量31.6 kD;等电点为4.65,具有Tropomyosin家族的蛋白保守结构域。成功构建重组原核表达pEASY-E1-Tropomyosin并诱导表达重组蛋白。     

家蝇溶菌酶MDLZM2基因的克隆、序列分析及原核表达

对家蝇溶菌酶(Musca domestica lysozyme,MDLZM2)基因进行克隆、序列分析,构建原核表达载体并在大肠杆菌中表达。从Gen Bank家蝇基因组中筛选获得MDLZM2基因。以该基因的序列设计引物,进行PCR扩增,测序分析获得该基因完整编码序列。运用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白的基本理化性质、信号肽、二级结构、三级结构和保守结构域等方面进行预测和分析。构建p EASY-E1-MDLZM2重组质粒,转化到大肠杆菌BL21(DE3)p Lys S Chemically Competent Cell中进行诱导表达及纯化。结果表明MDLZM2基因ORF全长552 bp,编码183个氨基酸,理论分子量21.2 k Da;等电点为6.13,具有Lysozyme家族的蛋白保守结构域。成功构建重组原核表达p EASY-E1-MDLZM2并诱导表达、纯化重组蛋白,为进一步研究该蛋白的生物学及免疫学活性奠定了基础。     

中国贵州宽阔水自然保护区蚋相初报及三新种描述(双翅目,蚋科)(英文)

首次记载贵州省宽阔水自然保护区蚋科Simuliidae14种,并记述其中3新种,包括遵义蚋Simulium(Simulium)zunyiense sp.nov.和新尖板蚋Simulium(Simulium)neoacontum sp.nov.以及隶属于山蚋亚属Simulium(Montisimulium)的离板山蚋Simulium(Montisimulium)separatum sp.nov.。模式标本存放于贵阳医学院生物学教研室。遵义蚋,新种S.(S.)zunyiense sp.nov.(图1～13)隶属于蚋亚属杂色蚋组variegatum group,与本组已知近缘种主要区别在雄尾结构,如生殖肢端节,生殖腹板和中骨的形状特殊。正模♂,贵州遵义市宽阔水自然保护区(28°12’N,107°18’E;海拔1483m),2010-09-20,修江帆,陈黔采。词源:新种种名源自模式产地。新尖板蚋,新种S.(S.)neoacontum sp.nov.(图14～19)隶属于蚋亚属淡足蚋组malyschevi group,与尖板蚋S.(S.)acontum Clen et al.,近似,但雄虫生殖肢端节,生殖腹板和中骨的形状迥异,此外,其呼吸丝排列方式也有明显差异。正模♂,贵州宽阔水自然保护区让水(28°17’N,107°08’E;海拔682m),2010-08-13,修江帆采。词源:新种种名源自其形态极似尖板蚋S.(S.)acontum,冠以"neo"以示区别。离板山蚋,新种S.(Montisimulium)separatum sp.nov.(图20～28)隶属于山蚋亚属Subgenus Montimulium与绒丝山蚋S.(M.)nemoriragum(Datta,1973)近似,主要区别是雌虫生殖板内缘远离,蛹呼吸丝背对具短茎。此外,幼虫头扇毛和肛鳃次生叶数目也有明显差异。正模♀,贵州宽阔水自然保护区大洞(28°12’N,107°18’E;海拔1483m),2010-08-20,修江帆,陈黔采。词源:新种种名源自其雌虫生殖板内缘分离。     

不同诱导条件下家蝇(Musca domestica)三龄幼虫免疫相关基因的表达研究

旨在研究在不同诱导条件下家蝇三龄幼虫先天性免疫基因的表达情况。采用冷刺激、热刺激及革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和真菌注射诱导12 h后提取家蝇三龄幼虫总RNA。根据GenBank公布的家蝇磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因、攻击素(Attacin)、天蚕素(Cecropin)、防御素(Defensin)、双翅肽(Diptericin)、溶菌酶(Lysozyme)、热休克蛋白(Heat shock protein,HSP)及家蝇抗真菌肽(MAF-1)基因序列进行RT-PCR反应,以GAPDH基因为内参照,分析在不同诱导条件下家蝇三龄幼虫先天性免疫基因的表达情况。结果显示,不同条件诱导下,家蝇免疫相关基因表达显现较大差异,微生物诱导比物理刺激诱导后家蝇免疫相关基因表达水平高;真菌、阳性菌诱导后家蝇免疫相关基因表达量最高,阴性菌次之;冷刺激诱导最低。微生物及物理刺激均能激活家蝇的免疫系统,在不同条件刺激下,家蝇幼虫机体免疫应激反应不同。     

家蝇3种丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serpin)基因在感染白色念珠菌后的表达

研究家蝇丝氨酸蛋白酶抑制剂（ Serpin ）基因 Sp2、Sp13、Sp16 在感染白色 念珠菌后的表达模式。利用白色念珠菌刺激家蝇幼虫,对收集的标本进行逆转录,以 GAPDH 为内参基因,通过qPCR技术检测3条 Serpin 基因在家蝇感染后不同时间点及不同组织中的表达特征,统计分析结果。结果表明,不同时间点感染组和对照组比较, Sp2 mRNA在3 h、6 h和48 h的表达量比对照组高; Sp13 mRNA在6 h的表达量比对照组高,在3 h和24 h时的表达量比对照组低; Sp16 mRNA在6 h、24 h和48 h时的表达量比对照组高,在36 h时的表达量比对照组低。不同组织中感染组和对照组比较, Sp2 mRNA在3 h时,在血淋巴和脂肪体中的表达量比对照组高,在马氏管、气管和肠道的表达量比对照组低;12 h时,在血淋巴中的表达量比对照组高,在马氏管和唾液腺中的表达量比对照组低;24 h时,在脂肪体中的表达量比对照组低;48 h时,在血淋巴中呈高表达,在唾液腺中的表达量比对照组低。 Sp13 mRNA在3 h时,在唾液腺和脂肪体中的表达量比对照组高,在马氏管、体壁、血淋巴和气管中的表达量比对照组低;12 h时,在血淋巴中呈高表达,在体壁和脂肪体中的表达量比对照组低;24 h时,在血淋巴、气管和唾液腺中的表达量比对照组高,在脂肪体中的表达量比对照组低;48 h时,在马氏管、血淋巴、气管和脂肪体中的表达量比对照组高,在体壁和唾液腺中的表达量比对照组低。 Sp16 mRNA在3 h时,在马氏管和气管中的表达量比对照组低;12 h时,在马氏管和脂肪体中其表达量比对照组低;24 h时,其表达量在马氏管中比对照组高,在脂肪体中比对照组低;48 h时,在血淋巴中呈高表达,而在马氏管中的表达量比对照组低。家蝇3种 Serpin基因在白色念珠菌感染后均呈现出差异性表达,推测 Serpin 基因在家蝇免疫调节中具有协同调节作用。     

家蝇Thymosin(THY)基因的克隆及原核表达

采用EST测序技术从构建的家蝇(Musca domestica)幼虫c DNA质粒文库中筛选到胸腺肽(Thymosin,THY)基因,以该基因的c DNA文库质粒为模板,设计引物,通过PCR扩增,测序鉴定,获得THY基因完整编码序列。运用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白的基本理化性质、信号肽和亚细胞定位等方面进行预测和分析。构建p ET-28a(+)-THY重组质粒,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达。研究结果表明,THY基因ORF全长384 bp,编码127个氨基酸,理论分子量14.3 k D,等电点为5.22,具有THY家族的蛋白保守结构域。构建重组原核质粒p ET-28a(+)-THY,经IPTG诱导,蛋白在大肠杆菌中获得表达,经亲和层析柱纯化获得目的蛋白,Western blot检测发现纯化的目的蛋白大小正确。     

RNA干扰MDCht9基因的家蝇幼虫的转录组分析

家蝇(Musca domestica)属于双翅目昆虫,广泛分布于世界各地,目前家蝇抗药现象较为严重.为了筛选及挖掘与防治有害医学昆虫相关的分子靶标,本研究以家蝇幼虫为实验对象,采用RNAi方法沉默家蝇几丁质酶MDCht9基因后,分析幼虫mRNA转录组表达变化,初步探讨MDCht9的功能.研究结果表明,在注射dsRNA 24 h后,幼虫MDCht9 mRNA的表达显著下降85％,提示干扰有一定效果.实验组与对照组相比共筛选出378个基因差异表达显著,其中上调基因162个,下调基因216个,占所有被检测到转录RNA基因的百分比为2.66％.通过GO和KEGG相关生物信息学分析,挖掘出涉及幼虫时期生长发育、蛋白质的消化与吸收、雄虫性成熟、物质代谢等相关通路基因.采用实时荧光定量PCR对差异基因进行验证,与转录组结果一致.本实验通过RNAi方法成功降低MDCht9基因mRNA表达,MDCht9基因参与幼虫时期生长发育、蛋白质的消化与吸收、雄虫性成熟、物质代谢等功能.本研究结果有助于后续生物信息学分析及为家蝇生长发育关键基因的挖掘提供基础数据,为害虫防治提供新的靶标途径.     

不同载体表达的家蝇β-葡萄糖苷酶生物学活性比较

克隆家蝇内源性β-葡萄糖苷酶(beta-glucosidase,BG)基因,建立两种原核表达体系和一种真核表达体系,分别检测表达产物的活性,比较不同表达体系对其表达水平及重组蛋白酶学性质的影响,为进一步研究和利用家蝇BG酶奠定基础。本研究根据BG酶基因的cDNA序列设计引物扩增BG酶基因成熟肽的基因片段,分别采用表达载体pET-28a(+)和pEGX-4T-1构建原核表达体系并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。在65 kDa附近均出现特异性蛋白条带,进行Western Blotting鉴定证实重组质粒在其宿主菌E.coli BL21(DE3)中成功表达,命名为MDBG-1蛋白和MDBG-2蛋白。同时选用真核表达载体pPICZa A构建酵母分泌型表达体系在酵母细胞GS115中获得稳定的表达,将其命名为MDBG-3蛋白。采用七叶苷平板法和DNS法对三种表达体系所重组表达的蛋白进行酶活性鉴定和检测,显示3种表达体系所表达的融合蛋白均具有BG酶活性,其酶活力有所不同,且真核表达体系所表达的蛋白酶活性最高。本研究对家蝇β-葡萄糖苷酶基因表达的重组蛋白特性进行初步研究,为发现新的有效纤维素酶体系提供基础数据。     

家蝇3种丝氨酸蛋白酶抑制剂Serpin基因克隆、序列分析及表达模式

对家蝇3种丝氨酸蛋白酶抑制剂Serpin基因SP2、SP13和SP16进行克隆、序列分析和时空表达模式检测。运用瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统（ExPASy）和美国国家生物技术信息中心（NCBI）等有关的生物信息学分析工具，预测和分析3条Serpin基因编码蛋白质的结构与生物学功能。以RPS18（核糖体S18蛋白）为内参基因，采用实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）技术检测3条 Serpin 基因在家蝇不同发育时期，以及家蝇3龄幼虫中脂肪体、唾液腺、中肠、马氏管和体壁的表达特征。SP2、SP13、SP16基因序列的开放阅读框ORF全长分别为1191 bp、1137 bp和1212 bp，分别编码含396、378和403个氨基酸残基的蛋白质，其理论分子量分别为45315.3 Da、43701.5 Da和45011.5 Da，等电点分别为9.01、5.98和6.04，蛋白质的N端都含有一段信号肽，并具有Serpin基因的保守结构域，属于Serpin家族。SP2和SP16在蛋白质的C端含反应中心环（Reactive center loop，RCL)，而SP13 C端不含RCL。时空表达模式分析结果显示，SP2基因在2龄幼虫中的表达量最高，而雄蝇的表达量与卵期相比有所下调；SP13基因在蛹中的表达量最高，1龄幼虫和雌蝇中的表达量与卵期相近；SP16基因在2龄幼虫和3龄幼虫中的表达量最高，雄蝇与雌蝇的表达量与卵期相比有所下调。在家蝇3龄幼虫的各主要组织中，以体壁为参照，SP2基因在唾液腺表达水平最高，其次是脂肪体，中肠和马氏管均低于体壁；SP13基因在马氏管和脂肪体中的表达水平最高，中肠和唾液腺的表达量低于体壁；SP16基因在唾液腺、中肠、脂肪体和马氏管的表达量均低于体壁。推测Serpin基因在家蝇个体发育和免疫调节中起不同作用。     

家蝇β-葡萄糖苷酶基因的克隆及重组表达

克隆家蝇内源性β-葡萄糖苷酶(beta-glucosidase,BG)基因并建立原核表达体系,检测其表达产物的活性,了解家蝇内源性BG酶特点,为进一步解释家蝇极强环境适应能力和发现新的种群控制措施提供分子生物学基础。以草地贪夜蛾等结构信息相对完整且研究较为透彻的6种代表性昆虫的BG酶基因序列为参照对象,利用同源克隆结合RACE-PCR的方法,从家蝇cDNA中克隆得到BG酶基因的全长cDNA序列并对其进行生物信息学分析。分别采用原核表达载体pET-28a(+)构建原核表达体系并在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中诱导表达BG酶基因的融合蛋白。采用七叶苷平板显色法和DNS法检测表达体系融合蛋白的酶活性,并对其性质进行初步的分析。家蝇体内克隆得到了长度为1933 bp的家蝇BG酶基因全长cDNA序列,推导其为562个氨基酸残基组成的蛋白多肽。重组原核质粒经诱导表达后,在65 kDa附近均出现特异性蛋白条带,证实重组质粒成功表达。重组表达的家蝇BG酶兼具内切β-1,4-葡聚糖酶、外切β-1,4-葡聚糖酶和BG的酶活性。家蝇BG酶是一种新的多功能纤维素酶,是昆虫纤维素酶研究的重要补充。