重组大肠杆菌产NAD激酶发酵条件的优化研究

本研究将重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/p ET30α(+)-NADK作为NAD激酶生产菌种,对其产酶发酵培养基及发酵条件进行优化。采用Placket-Burman(PB)设计先筛选出影响重组菌产NAD激酶的三个主要因素:葡萄糖浓度、Mg SO4浓度和诱导表达时间,试验结果表明,增加葡萄糖和Mg SO4的浓度及缩短诱导表达时间对产酶有利。根据中心组合实验设计(Central Composite Design,CCD)原理,利用PB设计确定的这三个显著影响因素,通过最陡爬坡实验逼近最大响应区域,挑选出实验范围内的最优点,以此作为响应面中心组合设计的中心点,用NAD激酶酶活作为响应值,使用Design Expert 8.0软件设计中心组合实验,通过对实验数据进行分析,得出最佳发酵培养基成分及发酵条件为:葡萄糖14.24 g/L、酵母粉8 g/L、胰蛋白胨8 g/L、Mg SO40.94 g/L、Na Cl 5g/L、NH4Cl 2 g/L、KH2PO42 g/L、K2HPO49 g/L,诱导表达时间8.34 h,接种量2%。在此最佳条件下,NAD激酶酶活实验验证值可达10.17 U/mg,与优化前相比提高了2.77倍。对诱导表达结束后的细胞上清液进行SDS-PAGE分析也证明优化取得了显著的效果。     

嗜热脂肪地芽孢杆菌NAD激酶克隆表达及酶学性质研究

NAD激酶能催化NAD生成NADP。本研究采用PCR技术从嗜热脂肪地芽孢杆菌基因组中获得NAD激酶基因,以pET30a（＋）为表达载体、E．coliBL21（DE3）为宿主菌,实现其在大肠杆菌中异源表达,并进行酶学性质研究。结果显示,嗜热脂肪地芽孢杆菌中NAD激酶编码基因大小为816bp,酶分子量大约为35kD。酶学性质分析表明,来源于嗜热脂肪地芽孢杆菌的NAD激酶最适反应温度和pH分别为35℃、pH7．5,在35qC中保温2h后仍能保持80％左右的活性。Mn2＋、Ca2＋对该酶有较强的激活作用,在最适反应条件下该酶的比活力为4．43U／mg。动力学性质分析结果显示NAD激酶对底物NAD催化的k和圪。,分别为1．46mmol／L和0．25tzmol／（L·min）。NAD激酶在大肠杆菌的异源表达为以NAD为底物生物合成NADP提供了更多生物资源。     

聚乙烯醇-明胶复合膜固定化重组大肠杆菌NAD激酶的研究

为提高烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)激酶的稳定性,采用复合膜对NAD激酶进行固定化研究。选用聚乙烯醇(PVA)、聚乳酸(PLA)、海藻酸钠(SA)和明胶(GEL)膜材料固定化NAD激酶。通过单因素实验确定最佳固定化条件为:PVA∶GEL为4∶1,加酶量为0.6 mL,固定化时间为6h,固定化温度为35℃,此时酶活力回收率达到最高值84%。固定化酶酶学性质分析结果表明,与游离酶进行比较,固定化后NAD激酶的最适温度由50℃提高至55℃,最适pH由8.0降至7.0,NAD激酶的热稳定性和pH稳定性均得到显著提高,但固定化酶的亲和力降低。固定化NAD激酶重复利用6次后,酶活性依然可维持初始酶活性的75%以上,表明聚乙烯醇-明胶复合膜固定化酶具有良好的操作稳定性。