野生罂粟COR、BBE基因片段融合及其RNAi载体构建

可待因酮还原酶(COR)与小檗碱桥酶(BBE)是吗啡合成代谢途径的关键酶,其活性大小直接影响着吗啡合成途径中生物碱的代谢合成。采用RT-PCR从罂粟幼叶克隆出COR和BBE基因全序列,同源性比较结果显示,它们与GenBank上已报道的COR和BBE基因高度同源。利用blast及分子生物学软件DNAStar对COR和BBE基因的cDNA序列同源性进行分析比较,分别从各基因中筛选和克隆了一段同源性极低、约400～500 bp的片段;并应用重叠PCR法将其拼接成744 bp的融合基因BC,以中间载体pHANNIBAL和植物表达载体pART27为基础,构建了以CaMV 35S启动子驱动的含有“正向BC融合片段- pdk内含子-反向BC融合片段”的ihRNAi植物表达载体,通过转化野生罂粟,初步研究了以COR和BBE基因为靶标的RNAi对内源吗啡合成的抑制效果,为进一步培育低吗啡高蒂巴因的罂粟种质提供了依据。     

地黄GGPPS1基因克隆及表达分析

以地黄为材料,通过分析地黄转录组数据,设计特异性引物,克隆了地黄牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶（geranylgeranyl pyrophosphate synthase,GGPPS）基因的cDNA序列,命名为RgGGPPS1,GenBank登录号为KU258808。同时在生物信息学分析的基础上,进行原核表达、纯化以及组织特异性表达分析。结果显示：（1）RgGGPPS1基因开放阅读框为987 bp,编码328个氨基酸。（2）生物信息学分析结果显示,RgGGPPS1蛋白含有2个富含天冬氨酸的基序(DDXXXXDD和DDXXD),与芝麻等双子叶植物中的GGPPS蛋白相似性较高。（3）利用构建的原核表达载体pET 32a RgGGPPS1在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中成功表达RgGGPPS1重组蛋白,采用Ni²⁺亲和层析得到了纯化的RgGGPPS1重组蛋白。（4）荧光定量PCR结果显示,RgGGPPS1基因在根中表达量最高,叶、茎中表达量较低。研究结果为进一步研究RgGGPPS1基因在地黄环烯醚萜苷生物合成途径中的功能奠定了基础。     

不同生态区罂粟种质的遗传多样性ISSR分析

为了揭示罂粟种质的遗传多样性,利用ISSR分子标记进行遗传多样性研究,从100条随机引物中筛选出9条多态性引物对所有样品扩增,共检测到109个等位变异位点,引物等位位点数在9～16之间,平均每条引物有12个等位变异,其中,引物807的等位位点最多,为16个。引物等位位点多态性信息量PIC值为0.77～0.92。其中引物807的PIC值最大(0.92),引物847的PIC值最小(0.77),遗传相似系数在-0.452～0.981之间,且明显聚为2个类群;亲缘关系和地理分布呈一定的相关性,但没有形成明显的地理变异模式;本研究将为罂粟种质资源科学有效利用提供理论依据。     

野生罂粟RNAi表达载体的构建及遗传转化

通过PCR方法从质粒pGEM-bc中克隆野生罂粟BBE-COR融合基因片段约760 bp,以pHANNIBAL和植物表达载体pCAMBIA3300为基础,将克隆到的BBE-COR融合基因正向和反向片段分别插入pdk内含子的两边,经酶切、PCR鉴定及序列分析表明,特异性RNAi表达载体p3300-pHR构建成功.采用直接转化法,将重组子导入根癌农杆茵AGL1中.以野生罂粟茎尖生长点为转化受体,用农杆茵介导法将目的基因转入野生罂粟中.经卡那霉素和除草剂筛选后,共获得53株转基因植株,PCR检测后,其中14株表现阳性,可初步确定目的基因已经整合到野生罂粟基因组中.     

野生罂粟COR基因克隆及转化

以野生罂粟幼叶总RNA为模板,采用RT-PCR技术克隆到可待因酮还原酶基因COR的cDNA序列,所获得的cDNA序列全长966 bp,具有完整的ORF,编码321个氨基酸.Blast分析表明,该片段与GenBank中的可待因酮还原酶基因(COR)家族相似性很高,其中与基因COR1.1的一致性最高可达98.96%,该片段命名为COR(GenBank,登录号为FJ624147).以中间载体pHANNIBAL和植物表达载体pART27为基础,构建了CaMV-35S启动子驱动的含可待因酮还原酶基因片段反向重复序列的RNAi双元表达载体pARC,转化烟草获得转基因植株.