野油菜黄单胞菌野油菜致病变种中一个与EPS合成有关的新基因的鉴定

用转座子Tn5gusA5对野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv.campestris,简称Xcc)野生型菌株8004进行诱变,分离到一批胞外多糖(EPS)合成减少的突变体。采用TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)分析突变体的Tn5gusA5插入位点,发现其中一株编号为151D09的突变体的插入位点位于Xcc 8004菌株的基因组编号为XC3695的ORF内,该ORF功能尚未见报道。序列分析表明,该ORF演绎的编码产物与Serratia marcescens的kdtX基因和Klebsiella pneumoniae的waaE基因演绎的编码产物分别具有52%和50%的相似性,并具有第2家族糖基转移酶的功能域, 因此暂将该ORF命名为waxE基因。用同源双交换方法构建了waxE基因的缺失突变体,并采用PCR和Southern杂交的方法对突变体进行了验证。waxE基因缺失突变体在营养丰富培养基的生长繁殖不受影响,但其EPS产量与野生型菌株8004相比,降低35%左右,并且一段PCR合成的包含waxE基因的DNA片段能反式互补waxE基因缺失突变体,恢复缺失突变体的EPS产量,表明Xcc waxE基因与EPS的生物合成有关。     

影响农杆菌介导玉米愈伤组织遗传转化因素的研究

用农杆菌介导玉米愈伤组织的转化,其筛选的结果得到的抗性愈伤组织受玉米愈伤组织的继代时 间、浸染的农杆菌菌液浓度、共培养的温度以及其共培养时间等因素的影响。玉米愈伤继代后7～9d,农杆菌 浓度为OD600值0.3左右、共培养温度约22℃、培养时间3d时,抗性愈伤的获得率最高。     

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种8004菌株wxcA基因与EPS的产量有关

在以前的工作中,采用转座子Tn5 gusA5对野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xcc)8004菌株进行诱变,获得一批胞外多糖(EPS)合成减少的突变体,对这些突变体的Tn5 gusA5的插入位点进行分析后,发现有两株突变体是wxcA基因不同插入位点的突变体。以前认为wxcA基因与脂多糖(LPS)的O-抗原合成有关而与EPS的合成无关。为明确wxc4基因的功能,对8004菌株的wxcA基因进行缺失,获得的△wxcA突变体的EPS产量与野生型菌株相比,减少了50％,并且一段PCR合成的包含wxcA基因的DNA片段能反式互补△wxcA突变体,恢复突变体的EPS产量。这证实了8004菌株的wxcA基因与EPS的合成产量有关。     

野油菜黄单胞菌分泌组双向电泳样品制备方法的建立

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc)是十字花科植物黑腐病的病原细菌。我们建立了Xcc的蛋白质组学研究平台,用于分离、鉴定该菌的致病相关蛋白。为了减少胞外多糖(exopolysaccharide,EPS)对蛋白材料质量的影响,我们构建了EPS缺陷的Xcc8004ΔgumB突变体。本研究以Xcc8004ΔgumB出发菌株,用诱导培养液培养,取细胞上清通过超滤浓缩得到蛋白质粗提物,分别采用丙酮沉淀法、试剂盒纯化法和丙酮沉淀-试剂盒联用法来纯化蛋白质粗提物,通过比较双向电泳的结果优选最佳的样品制备方法。结果证明丙酮沉淀-试剂盒联用法较为理想,所得双向电泳图片清晰,分辨率高。因此,此方法可以用于制备野油菜黄单胞菌分泌组双向电泳样品,并可以满足进一步研究的需要。     

萝卜种质资源对黑腐病的抗性鉴定与筛选

对40份初选萝卜种质分别接种Xcc8004和XccBJ两个菌株,进行黑腐病苗期抗性鉴定,对其中8份代表性萝卜种质肉质根切片接种Xcc8004进行抗性鉴定和27份萝卜种质幼苗接种8个效应物基因进行过敏反应鉴定。结果表明:不同萝卜种质苗期对黑腐病的抗性存在显著差异,筛选出高抗Xcc8004的材料3份、抗病1份、中抗4份,高抗XccBJ的材料1份、抗病2份、中抗5份。萝卜苗期对Xcc8004和XccBJ的抗病性极显著相关,幼苗和肉质根对Xcc8004的抗病性极显著相关。筛选出17份对不同效应物表现过敏反应的萝卜种质。对效应物XC₀241表现过敏反应的种质数最多,对XC₀542和XC₀541表现过敏反应的种质数次之。不同抗源对不同效应物的过敏反应程度有所不同。稳定可靠抗病资源的获得为萝卜抗病育种和抗病机理的深入研究提供了基础材料。     

一株降氰细菌的筛选及其转化特性初步研究*

从污染土壤中分离一株高效降氰菌株DN25,经表型分析和16SrDNA分析,初步判断为产碱杆菌(Alcaligenessp.)。该菌株耐氰能力强,能在氰浓度达1000mg/L的环境中生长。其生长和转化的最佳温度和pH分别为30℃和8.0,10h对氰浓度为500mg/L的溶液转化率可达到99%。同时菌株也可有效转化亚铁氰化钾,对于氰浓度相当于500mg/L的亚铁氰化钾液,12h的转化率可达到96%。     

抗冻蛋白(afp)基因表达载体的构建及对香蕉胚性细胞悬浮系的转化

通过PCR从‘京都七寸人参'胡萝卜基因组DNA中扩增抗冻蛋白基因,测序结果表明该基因的核苷酸序列与从宁夏‘吴忠'胡萝卜中克隆的完全一致。先后将获得的胡萝卜afp基因克隆和亚克隆至pMD18-T和pBI121,构建植物表达载体pBI121-afp。通过冻融法将pBI121-afp导入根癌农杆菌EHA105中。以香蕉栽培品种‘北大矮蕉'的胚性细胞悬浮系为受体,采用农杆菌介导法将胡萝卜afp基因导入其中,然后在Kanamycin的选择压力下通过体细胞胚发生途径进行植株再生。共获得抗性再生植株9株,其中两株经PCR检测呈阳性,可初步确定目的基因已经整合到这两株转基因香蕉植株的基因组中。     

十字花科黑腐病菌III型效应物XopXccR1植物亚细胞定位

[目的] 植物病原细菌通过III型分泌系统（type III secretion system,T3SS）将III型效应物（type III secreted effectors,T3SEs）分泌转运到宿主细胞的不同位点上,进而行使不同的致病功能。本研究旨在确定Xcc 8004 III型效应物中分子量最大的蛋白XopXccR1在植物中的亚细胞定位。[方法] 利用生物信息学方法分析XopXccR1的跨膜信息。通过同源重组方法将XopXccR1全长、N端（1–1220 aa）和C端（1221–2030 aa）分别克隆到植物表达载体pCAMBIA-2300-35S：：EGFP上,利用根癌农杆菌介导的瞬时表达浸染本生烟,通过激光共聚焦显微镜观察亚细胞定位结果。[结果] XopXccR1全长和N端定位在本生烟细胞膜上,而C端定位在细胞质中。[结论] XopXccR1的N端与C端可能分别存在定位信号,N端信号主导全长蛋白的最终定位。     

一株降氰细菌的筛选及其转化特性初步研究

从污染土壤中分离一株高效降氰菌株DN25,经表型分析和16SrDNA分析,初步判断为产碱杆菌(Alcaligenes sp．)。该菌株耐氰能力强,能在氰浓度达1,000mg／L的环境中生长。其生长和转化的最佳温度和pH分别为30％和8．0,10h对氰浓度为500mg／L的溶液转化率可达到99％。同时菌株也可有效转化亚铁氰化钾,对于氰浓度相当于500mg／L的亚铁氰化钾液,12h的转化率可达到96％。     

水稻细菌性条斑病菌中分泌蛋白质组表达谱的研究

水稻细菌性条斑病菌(Xamthomonas.oryzae pv.oryzicola,Xoc)是水稻的主要病原菌之一,其引发的水稻细菌性条斑病可造成水稻严重减产。本研究以Xoc GX01作为实验菌株,通过细菌培养、分泌蛋白提取、纯化获得总分泌蛋白,将样品酶解后通过LC-MS/MS技术鉴定了分泌蛋白质表达谱,共鉴定蛋白质661个,同时利用生物信息学技术对鉴定蛋白进行基因本体(gene ontology,GO)生物学分类,对生物功能、生物进程以及细胞组件进行了说明。为阐明植物病原菌的作用机理以及植物-病原细菌互作提供了理论基础。