中老缅边境蚊虫标本中Nam Dinh病毒的分离和鉴定

2012年在云南省南部中老缅边境地区采集的库蚊中分离到3株病毒(YN12039、YN12040、YN12060),该病毒只引起C6/36细胞发生病变。负染电镜观察病毒颗粒呈球形,直径60~80nm,有囊膜,表面有刺突。采用RTPCR方法对分离株的RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA-polymerase,RdRp)、HEL1(superfamily 1helicase)、S蛋白(spike protein)基因进行扩增,同源性分析显示3株云南新分离株与Nam Dinh病毒(NDiV)RdRp、HEL1、S蛋白氨基酸序列相似度最高,均为98%以上。系统进化分析结果表明,3株云南新分离株与NDiV的亲缘关系最近,处于同一进化分支。该研究结果丰富了NDiV病毒的信息,对NDiV病毒分子特征、分布区域和物种嗜性等特征提供了数据参考。     

中国新疆维吾尔自治区不明原因发热人群中Tahyna病毒感染状况调查

本研究通过对新疆地区不明原因发热人群血清Tahyna病毒抗体进行检测,以了解Tahyna病毒在当地的感染状况及分布特征。通过间接免疫荧光方法对新疆维吾尔自治区南部喀什地区、北部伊犁地区742例不明原因发热患者急性期血清标本进行Tahyna病毒抗体检测,并对IgM抗体阳性标本平行进行Tahyna病毒、Snowshoe hare病毒和Inkoo病毒三种抗原性相似的布尼亚病毒的蚀斑减少中和试验。研究结果显示新疆南部喀什地区采集不明原因发热患者急性期血清中,IgM抗体阳性率5.3%,IgG抗体阳性率18.3%;新疆北部伊犁地区采集的急性期患者血清标本中并未发现TAHV IgM抗体阳性;蚀斑减少中和试验结果显示,TAHV IgM抗体阳性患者血清中Tahyna病毒中和抗体滴度较其它两种布尼亚病毒中和抗体滴度升高明显。本研究证实新疆南部地区不明原因发热人群存在Tahyna病毒的急性感染和既往感染,为相关疾病的进一步监测提供基础。     

辛德毕斯病毒复制子载体系统的构建

To construct vector system of XJ-160 virus,a Sindbis virus isolated in China,recombinant vector pBRepXJ together with its helper plasmid pBR-H were derived from XJ-160 viral infectious clone pBR-XJ160 by overlap-PCR.To quantitatively and qualitatively verify the function of the replicon system,recombinant plasmids pSinRep-EGFP,pBRepXJ-EGFP,pSinRep-R and pBRepXJ-R were constructed by cloning report genes of enhanced green fluorescent protein(EGFP) or Renilla luciferase(R.luc) into pBRepXJ or pSinRep5,a comme...     

我国分离的盖塔病毒衣壳蛋白基因和3'非翻译区分子特征研究

对我国海南省和河北省分离到的3株盖塔病毒(GETV)(M1、HB0215-3和HB0234)进行衣壳蛋白基因和3'UTR区序列测定,并分析比较该病毒的分子生物学遗传特征.首先应用逆转录聚合酶链反应扩增出病毒衣壳蛋白基因和3'UTR片段,纯化后连接到载体中进行测序,然后用Clastal X和DNASTAR软件对测定的核苷酸和推测的氨基酸序列进行比较分析,用MEGA软件绘制系统发生树.3株病毒衣壳蛋白基因分别由801、804和804个核苷酸组成,分别编码267、268和268个氨基酸,3株病毒之间核苷酸和氨基酸序列同源性为97.6%～100%和97.8%～100%,与其他GETV分离株核苷酸同源性在95.4%～99.6%之间.3株病毒3'UTR分别由411、401和401个核苷酸组成,发现中国株存在10个(45～54位)核苷酸缺失和2个(64位、148位)特有的核苷酸位点.进化分析表明盖塔病毒之间的进化关系与分离年代相关,中国境内流行的盖塔病毒是相对独立的一个类群.     

三重融合PCR法构建感染性辛德毕斯嵌合病毒cDNA克隆

利用三重融合PCR法,即将3个DNA片段放在同一个反应里进行长片段PCR扩增法,融合得到了包含辛德毕斯病毒XJ-160株结构基因E3、E2、6K、3′UTR和辛德毕斯病毒YN87448株结构基因E1的融合DNA片段E3E26KE13′UTR。通过此融合片段两端引入的XbaI和XhoI酶切位点将其连接到XJ-160株的感染性全基因组cDNA克隆骨架上,成功构建了辛德毕斯病毒株XJ-160与YN87448外膜糖蛋白基因E1相互替换的嵌合病毒cD-NA克隆,命名为pBR-XJ160YE1。该克隆线性化后经体外转录,RNA转录体脂质体法转染BHK-21细胞,36h后细胞发生病变。间接免疫荧光检测到病毒蛋白的表达。提取5次传代后细胞上清中病毒RNA,RT-PCR法检测证明病毒来源于嵌合病毒cDNA克隆。此感染性辛德毕斯嵌合病毒cDNA克隆可以作为研究辛德毕斯病毒E1糖蛋白基因相关功能及XJ-160病毒和YN87448病毒存在单方向血清学反应的分子机理的分子生物学工具。     

我国新分离虫媒病毒的初步鉴定

1990－1994年,从新疆地区的蚊、蜱和病人血清分离了多株病毒,为了明确这些病毒的分类地位,对其中的20株病毒进行了组织培养细胞感染实验和血清学检验,对部分毒株做了动物接种实验和理化性质鉴定。结果显示：20株病毒均可使BHK－21细胞病变（1－3天）,主要表现为细胞圆宿、聚集,融合,破碎,脱落等;致Vero细胞病变为2－4天;15株病毒致C6／36细胞病变（2－4天）,5株病毒对C6／36细胞连续观察7天未见细胞病变。11株病毒对乳鼠2－4天致死,对成年鼠2－5天致死。选取6株病毒进行理化性质鉴定,4株病毒（90260、91002、91004和91028）对5－氟脱氧尿苷耐受,对乙醚和酸敏感,提示为有膜RNA病毒;一株病毒（90265）对5－氟脱氧尿苷、乙醚和酸均敏感,提示为有膜DNA病毒;另一株病毒（9059）对5－氟脱氧尿苷耐受,对乙醚和酸也耐受,提示可能为无膜RNA肠道病毒。20株病毒中,17株病毒与甲病毒、乙型脑炎病毒和布尼亚病毒的特异性免疫腹水不反应,提示这些病毒中可能不存在甲病毒、黄病毒和布尼亚病毒;3株病毒（90260、91002和91004）只与甲病毒的特异性免疫腹水反应,与乙型脑炎病毒和布尼亚病毒的不反应,提示这三株病毒为甲病毒。     

XJ—160病毒复制子型表达载体的构建

D-160病毒是我国首次分离的辛德毕斯病毒,全基因组测序已经完成。本文利用该病毒全基因序列首先构建了全基因组cDNA克隆质粒,在此基础上,利用基因重组技术将病毒结构基因序列替换为含有多个单酶切位点的序列,得到复制子表达载体质粒pRepxjl60。为验证载体的功能,将报告基因绿色荧光蛋白(EGFP)和β-半乳糖苷酶基因(lacZ)分别插入到载体的多克隆位点,得到两个表达质粒;经体外转录获得的转录体RNA转染BHK-21细胞后14h,可检测到报告基因的表达。结果表明我们构建的XJ-160病毒复制子型表达载体具有自主复制功能,可以表达异源基因。本研究为进一步开发具有我国自主知识产权的甲病毒载体奠定了基础。     

nsP2-726Pro定点诱变对辛德毕斯病毒XJ-160复制子载体特性的影响

为观察nsP2-726Pro定点诱变对辛德毕斯病毒(Sindbis virus,SINV)XJ-160复制子载体特性的影响,以XJ-160病毒复制子载体pBRepXJ为分子基础,利用定点诱变方法分别构建突变载体pBRep-726L、pBRep-726S、pBRep-726V和pBRep-726A。将新霉素抗性基因(Neomycinr,Neor)克隆到pBRepXJ和各突变载体中,通过细胞培养方法观察nsP2-726Pro定点诱变对载体致细胞病变作用(Cytopathic effect,CPE)的影响;并将增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green-fluorescent protein,EGFP)和海肾萤光素酶(Renilla Luciferase,R.luc)报告基因分别插入到各载体中,定性与定量检测定点诱变对复制子载体自主复制能力的影响。实验结果表明,突变载体pBRep-726V和pBRep-726A在BHK-21细胞中的自主复制能力高于pBRepXJ,所诱发的细胞病变进程更快。替换突变nsP2-726Pro→Leu的引入使载体在保持包装能力的同时,完全丧失在细胞上引起CPE的能力。而pBRep-726S则具有中间表型。提示nsP2-726Pro定点诱变在影响XJ-160复制子载体自主复制能力的同时,也改变了CPE的进程。这将为研究辛德毕斯病毒基因组结构与功能的关系及构建非细胞病变的甲病毒载体奠定基础。