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1.
构建携带人尿激酶原突变体cDNA的重组腺病毒,通过该腺病毒介导实现外源基因在山羊乳腺中表达。通过大肠杆菌内同源重组将人尿激酶原突变体cDNA插入到腺病毒载体中,经过293细胞包装获得重组腺病毒,直接注射到泌乳山羊乳腺,收集感染后1~4天的乳汁,利用纤维蛋白溶圈试验、Western blot、ELISA检测乳清中尿激酶原突变体的表达。结果显示病毒注射后1~4天乳清中均可检测到尿激酶原的表达,其表达量可达0.41mg/ml。该方法可以实现重组蛋白在山羊乳腺的短期表达,可能是大规模生产临床医疗蛋白的一条经济有效的途径。  相似文献   
2.
根据猪α-actin基因已知DNA序列设计合成了两个特异性引物,以猪基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到α-actin 5'调控序列,然后与线虫ω-3脂肪酸去饱和酶基因cDNA、去除CMV启动子的表达载体pcDNA3.1连接构成肌肉特异性表达载体pcDNA3.1-AF,小鼠股四头肌注射该重组载体,RT-PCR检测证明...  相似文献   
3.
诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)是利用细胞重编程技术人工获得的与胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)功能类似的细胞,能分化成包括三胚层在内的所有细胞类型,并且规避了ESCs的伦理学争议和移植后的免疫排斥问题,具有十分广阔的应用前景。对iPSCs体外诱导为生殖细胞所用的诱导物及其诱导效果进行了综述,生殖细胞发育机制的研究有望促进未来生殖和发育技术的进步。  相似文献   
4.
目的:构建肌肉特异性表达线虫ω-3脂肪酸去饱和酶的肌肉特异性载体,证明其表达的有效性.方法:化学合成292bp的带有肌肉特异性转录因子结合位点的DNA序列,然后与线虫ω-3脂肪酸去饱和酶基因cDNA、去除CMV启动子的表达载体pcDNA3.1连接构成肌肉特异性表达载体pcDNA3.1 - SF,4w龄C57BL/6小鼠肌肉注射该重组载体,RT - PCR检测证明其表达有效性.结果:DNA测序结果证明合成的292 bp片段带有肌肉特异性表达元件;PCR鉴定显示启动子片段正确地插入到目的基因上游;RT - PCR鉴定显示肌肉内ω-3脂肪酸去饱和酶基因得到有效转录.结论:该试验为在转基因动物的肌肉中表达外源基因奠定了基础.  相似文献   
5.
目的:构建山羊乳腺特异性表达尿激酶原突变体的重组慢病毒载体,证明其表达的有效性。方法:将劳氏肉瘤病毒增强子/启动子、复制缺陷型人免疫缺陷病毒(HIV-1)的5′端长重复序列(LTR)、HIV-1ψ包装信号、HIVRev反应元件、山羊β-酪蛋白调控序列、尿激酶原M13cDNA、AU3/3′LTR、牛生长激素(BGH)基因poly(A)依次连接,构建乳腺特异性表达的慢病毒载体,通过体外转染人乳腺癌细胞系MCF-7、中国仓鼠卵巢细胞及泌乳山羊乳腺注射证明其表达有效性。结果:酶切鉴定证实山羊乳腺特异性表达载体构建正确;将该载体转染细胞,采用溶圈法和Western印迹检测证实了其表达的有效性;慢病毒载体注射到泌乳山羊的乳腺,在乳汁中也检测到了尿激酶原的表达。结论:为在转基因动物乳腺中表达尿激酶原突变体奠定了基础。  相似文献   
6.
由于人尿激酶原(pro-UK)存在凝血酶和纤溶酶原激活剂抑制剂(PAI-1)的作用位点,在生产和治疗过程中容易失去活性。采用PCR介导的定点突变技术对pro-UK基因进行了突变,构建了3种人pro-UK突变体, 分别将蛋白序列中的凝血酶作用位点Arg156突变成His156,构建成pro-UKM1;将PAI-1的作用位点Arg178、Arg179、Arg181突变为Lys178、Lys179、His181构建成pro-UKM2;同时将凝血酶和PAI-1的作用位点突变构建成pro-UKM3。分别在CHO细胞中获得稳定表达。并对3种突变体进行了SDS-PAGE纤维蛋白自显影和Western blot分析,证明3种细胞表达的pro-UKM与天然尿激酶原带型一致,绝大多数为单链。体外溶栓试验表明,pro-UKM1对凝血酶有抵抗性,pro-UKM2对PAI有抵抗性,pro-Ukm3能有效抵抗凝血酶和PAI的活性抑制。特别是pro-UKM3具有开发成新型溶血栓药物的潜力  相似文献   
7.
目的:构建针对猪肌肉生长抑制素mRNA的RNA干涉载体,并体内验证其有效性。方法:分别体外转染化学合成4个19 bp的siRNA片段获取针对肌肉生长抑制素的序列,构建RNA干涉载体,将上述载体注射到猪股四头肌中,RT-PCR检测证明其表达有效性及生肌调节因子mRNA水平的变化。结果:获得了针对肌肉生长抑制素的2个小干涉RNA序列,构建了2个重组载体,股四头肌注射混合后的等量重组载体,RT-PCR显示注射重组RNA干涉载体可显著降低肌肉生长抑制素的mRNA水平(约降低了40%),生肌调节因子mRNA水平显著上调(分别约为对照组的2.1~3.9倍)。结论:该试验为在转基因动物的肌肉中表达外源基因奠定了基础。  相似文献   
8.
目的:为使线虫Fat-1基因能够在牛中高效表达,通过密码子优化及全基因合成方法制备Fat-1基因,并构建其转基因表达载体。方法:通过生物信息学手段,将来源于线虫的Fat-1基因以牛为表达宿主进行密码子优化,将优化后的Fat-1基因命名为bFat-1;通过全基因合成方法获得bFat-1基因,构建pcDNA3.1-bFat-1真核表达载体。结果:通过密码子优化,影响Fat-1基因在牛中表达的密码子适应指数、优势密码子频率及GC含量等各项指标均有显著改善;全基因合成、克隆及测序结果显示已获得bFat-1基因;构建并鉴定了pcDNA3.1-bFat-1载体。结论:获得了适合牛体表达的Fat-1基因并构建了其转基因载体,为获得高效表达Fat-1基因的转基因牛细胞系奠定了基础。  相似文献   
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