HIV-1 p24和SIV p27两种ELISA试剂盒检测SIV p27抗原的比较

目的由于检测SIV p27抗原试剂盒来源困难,有时不稳定,鉴于HIV-1 p24与SIVp27有较强的交叉抗原,本研究比较HIV-1 p24和SIV p27两种ELISA试剂盒检测SIV p27抗原得出的结果是否存在一定的相关性。方法 HIV-1 p24和SIV p27两种ELISA试剂盒定性和定量检测样品中SIV p27抗原,并对检测结果进行回归和相关分析。结果 HIV-1 p24和SIV p27两种ELISA试剂盒检测SIV p27抗原的灵敏度分别是150 pg/mL和62.5 pg/mL。两种试剂盒检测病毒液和血浆中SIV p27抗原的定性结果一致。定量结果的统计分析得出病毒液的直线回归决定系数R2=0.857,直线相关系数r=0.926,P〈0.01,直线正相关程度较高;血浆的直线回归决定系数R2=0.512,直线相关系数r=0.716,P〈0.05,直线正相关程度较低。结论 HIV-1 p24 ELISA试剂盒能够替代SIVp27 ELISA试剂盒定性检测病毒液和血浆中SIV p27抗原,但只能定量检测病毒液中SIV p27抗原。     

SHIV-XJ02170感染恒河猴后期的传代特点和env基因变异

目的研究SHIV-XJ02170在中国恒河猴感染后期传代过程中病毒和宿主的变化特点,并分析env基因的序列变异。方法将感染中国恒河猴G0401V后期（5年）的SHIV-XJ02170病毒垂直传代2只猴（G0401V→G0402V→0403V）,同时,剔除G0401V猴CD8＋T细胞使潜伏的病毒大量复制后传代1只猴（G0401V→G0404V）,应用流式细胞术、病毒载量测定、序列分析等方法研究该病毒在猴体内长期适应后的病毒和免疫学指标及序列变异特点。结果 G0401V在感染后期仍能稳定传代,且表现出毒力增强的特点。其传代猴G0402V在传代后41 d死亡,外周血CD4＋T淋巴细胞衰竭,仅为43个/mL,符合艾滋病感染猴快速进展型的特征。剔除体内CD8＋T细胞之后的传代猴G0404V的表现类似G0401V,即长期低水平的病毒血症水平。env基因序列分析发现SHIV-XJ02170在G0401V体内长期适应后发生了可遗传的序列变异,并引起糖基化位点的改变。结论 SHIV-XJ02170在猴体长期适应后的传代过程中表现出向强毒株过渡的特征,为进行SHIV-XJ02170感染性克隆的构建奠定了良好的实验基础。     

SHIV1157ipd3N4细胞适应株的制备及其生物特性

目的体外制备SHIV1157ipd3N4病毒中国恒河猴细胞适应株,在细胞水平和中国恒河猴体内评价其生物学特性。方法用SHIV1157ipd3N4病毒阴道感染中国恒河猴,在血浆病毒载量高峰期采血分离外周血单核淋巴细胞（PBMCs）,与正常中国恒河猴PBMCs共培养。定期测定培养液中的P24抗原水平。当病毒复制达高峰期时收集培养上清,分装并冻存。测定病毒RNA载量、P24抗原浓度和TCID50。静脉感染中国恒河猴,研究该批次SHIV1157ipd3N4在体内的病毒学、免疫学指标变化及变异情况,分析其基本的生物学特性。结果本研究共制备了243 mL SHIV1157ipd3N4病毒原液,gp120序列分析表明病毒未发生变异,CCR5的嗜性也未发生改变。病毒载量为1.586×108 copies/mL,P24抗原水平为1.16×103 pg/mL,TZM-bl细胞测定病毒的TCID50为3.16×103/mL。1 mL SHIV1157ipd3N4静脉成功感染中国恒河猴G1004V,高峰期病毒载量达到1.0×106 copies/mL以上。结论此次制备的SHIV1157ipd3N4细胞适应株生物学特性稳定,适合作为毒种库构建SHIV1157ipd3N4/中国恒河猴模型。     

DEAE-葡聚糖在SHIV病毒TCID50滴定及扩增中的作用

目的 确定DEAE-葡聚糖对CEMx174细胞的半数抑制浓度,明确其在SHIV病毒TCID50滴定及病毒扩增中的促进作用.方法 分别使用含DEAE和无DEAE的DMEM完全培养基测定SHIVchn19p7的TCID50.用无血清DMEM培养基系列稀释DEAE,加入CEMx174细胞,使用cck-8测定细胞破坏率.分别选取DEAE浓度为28.125μg/mL和14.0625μg/mL的无血清DMEM培养基对CEMx174细胞预处理3 h.再加入SHIV-KB9病毒液,定期测定培养上清中的P24水平,同时做正常病毒对照和DEAE-1640对照,比对不同处理下的病毒扩增情况.结果 使用了DEAE后,SHIVchn19p7的TCID50达到了3.16×104TCID50/mL,不使用DEAE,病毒的TCID50测定为阴性.DEAE对CEMx174细胞的IC50为44.85μg/mL.经浓度为28.125μg/mL和14.0625 μg/mL的DEAE预处理后,SHIV-KB9病毒扩增在13 d～17 d达到高峰.而用不含DEAE的1640生长液培养的实验孔在19 d才开始出现阳性反应.结论 高浓度的DEAE对细胞有较强的杀伤作用,低浓度的DEAE对细胞的破坏率较低,并且能显著促进病毒扩增.DEAE在病毒进入细胞的过程中确实起了重要的作用.     

SHIV1157ipd3N4中国恒河猴细胞适应株静脉感染中国恒河猴有效浓度的确定

目的确定SHIV1157ipd3N4静脉途径感染中国恒河猴的有效病毒浓度,明确SHIV1157ipd3N4感染实验猴体内病毒复制和免疫损伤情况。方法 10只正常中国恒河猴分成6组,分别用10倍系列稀释的病毒液1 mL静脉感染,测定血浆病毒载量,CD4＋/CD8＋,CD4＋T淋巴细胞绝对数,分析感染后恒河猴体内病毒复制和免疫损伤情况。结果 5TCID50/mL以上浓度的SHIV1157ipd3N4能通过静脉途径感染中国恒河猴。结论该实验的成功进行为SHIV/中国恒河猴疾病及评价模型的建立奠定了良好的基础,为今后使用此模型评价抗病毒药物或疫苗提供了条件。     

猴D型反转录病毒巢式PCR检测方法的建立

目的建立SRV-1巢式PCR检测方法并进行初步应用。方法针对SRV-1env基因的保守区序列,设计特异性引物,以感染SRV-1 Raji细胞提取出的含有前病毒DNA的基因组DNA为模板,进行巢式PCR反应。扩增产物测序后与GenBank报道的序列进行同源比对。将DNA样本进行10倍梯度稀释,以检测巢式PCR反应的灵敏度。使用该方法对正常Raji细胞以及感染SIV、STLV的外周血淋巴细胞DNA样本进行扩增,检测该方法的特异性。用建立的巢式PCR方法检测40份储存猴血标本。结果使用巢式PCR扩增出的特异片段经测序分析,结果证实与GenBank报道的序列一致。所建立的巢式PCR检测法检测限度可达1.5×10-3ng/μL,而且方法特异。用此方法检测40份猴血标本,未检测到阳性标本。结论初步建立SRV-1的巢式PCR检测方法,该方法灵敏、特异,为SRV-1的检测提供了一个快速、有效的手段。     

猴副流感病毒SV5 PCR检测方法的建立与初步应用

目的建立检测SV5的PCR方法并加以初步应用。方法根据GenBank中报道的SV5序列,针对其中的SH基因设计引物进行PCR反应,扩增产物进行测序并用BLAST软件进行同源性比对,同时利用限制性内切酶的酶切反应以证实此PCR反应的特异性。在此基础上设计巢式PCR提高此方法的灵敏度。利用此方法对20份猴肾源细胞培养物和40份血清标本进行检测。结果利用设计的引物扩增出的序列测序结果证实与报道的SV5SH基因相对位置的序列一致。AccⅢ限制性内切酶可对PCR产物进行特异性酶切。巢式PCR比一次PCR的敏感度有所提高。用此方法检测的20份猴肾源细胞培养物和40份血清标本结果为阴性。结论初步建立了检测SV5病毒的PCR方法,排除实验室用20份猴肾源细胞培养物和40份血清标本SV5的污染。     

CXCR4嗜性SHIVKU-1病毒静脉感染中国恒河猴初步研究

目的了解SHIVKU一1静脉途径感染中国恒河猴的感染特点及进展规律。方法两只健康中国恒河猴,静脉感染SHIVKU-1病毒,定期采样检测血浆病毒载量、CD4＋／CD8＋比值、CD4＋T细胞绝对数变化和血清中抗SHIVKU-1特异性IgG抗体水平。多色流式技术分析外周血、腹股沟淋巴结和十二指肠粘膜固有层CD4＋T淋巴细胞记忆细胞亚群变化。结果两只实验猴成功感染SHIVKU-1病毒,一直到感染后3个月均保持稳定水平的病毒载量。外周血CD4＋T淋巴细胞下降明显,CD4＋／CD8＋T细胞比值严重倒置。CD4＋Tcm细胞比例在经历了感染早期的下降后,大幅升高,尤其是外周血和淋巴结。CD4＋Tem则在粘膜固有层中增加明显。结论SHIVKU．1静脉途径成功感染了中国恒河猴,为SHIV／中国恒河猴疾病及评价模型的建立奠定了良好的基础,为今后使用此模型评价抗病毒药物或疫苗提供了条件。     

SHIV病毒在猴体内的复制与传代

目的为建立SHIV艾滋病动物模型提供毒力较强的病毒株,将新合成的SHIV XJ02170病毒适应猴体,并增强其毒力。方法实验前采集猴血清并进行血清学检查和PCR检测。选出13只无SIV,STLV1,SRV D和B病毒感染的猴。第一批实验,将SHIV前病毒DNA质粒经肌肉注射到猴体内,每只500μg;SHIV病毒液,经静脉注射到猴体内,每只2ml。病毒质粒和病毒液各接种2只猴。当第一批猴体检出病毒后,10ml感染猴的全血,抗凝后静脉注射到第二批猴体内,当第二批猴检出病毒后再将10ml感染猴的全血静脉注射到第三批猴体内,连续传代4次。每批实验均定期采集血液标本,分别用肝素和EDTA抗凝,进行病毒分离;病毒基因PCR检测;CD4,CD8测定;病毒抗体检测。结果SHIV XJ02170病毒和SHIV XJ02170前病毒DNA质粒在猴体内的传代中均能分离出病毒;从传代猴的血浆和外周血单核细胞(PBMC)中检出了病毒DNA和RNA基因;CD4,CD8测定结果显示有暂时性倒置现象,后变为正常倒置与正常交替出现;在传代的猴血清中检测出特异性HIV病毒抗体。结论SHIV XJ02170病毒与SHIV XJ02170前病毒DNA质粒,均能在恒河猴体内复制。     

抗人B淋巴细胞单克隆抗体清除中国恒河猴体内B淋巴细胞效果观察

目的用抗人B淋巴细胞单克隆抗体（利妥昔单抗注射液,Rituximab）通过静脉滴注的方法敲除中国恒河猴体内B淋巴细胞,并观察其敲除效果,为建立B淋巴细胞缺失的恒河猴动物模型提供基础的实验数据。方法选取健康的中国恒河猴两只,静脉滴注抗人B淋巴细胞单克隆抗体,定期采集外周血、腹股沟淋巴结和十二指肠黏膜组织,制备淋巴细胞悬液,应用流式细胞术的方法系统性测定B淋巴细胞及T淋巴细胞亚群的变化。结果静脉滴注利妥昔单抗注射液后24 h,中国恒河猴外周血中B淋巴细胞的缺失即能达到100%,持续约14 d;腹股沟淋巴结中B淋巴细胞在静注后7 d缺失100%;十二指肠黏膜组织中B淋巴细胞在静脉滴注后7 d缺失达到90%,维持28 d。并且在成功敲除B淋巴细胞的情况下,CD4＋T及CD8＋T淋巴细胞无明显波动,维持在一个稳定的水平。结论利妥昔单抗注射液能有效去除中国恒河猴体内B淋巴细胞,为建立B淋巴细胞缺失动物模型奠定基础。