重组人骨形态发生蛋白-2生物学活性测定新方法的建立

目的:采用小鼠异位成骨技术及甲基麝香草酚蓝比色法检测重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)的生物学活性。方法:将rhBMP-2埋入小鼠肌间隙内,14d后取出新生组织,采用血清钙试剂盒检测其钙含量。结果:随着给药组剂量递增,相应地钙含量也增加,二者具有较强的量效关系。结论:此方法为本实验室独创,较传统的血清碱性磷酸酶方法更为方便、快捷,是一种能够定量检测rhBMP-2活性的新方法。     

含p53保守结合位点的microRNA表达载体的构建及应用

目的:构建含p53保守结合位点的microRNA(miRNA)表达载体,促进相关miRNA在具有野生型p53蛋白细胞中的高效表达。方法:改构miRNA表达载体pCMV-miR,在其多克隆位点前插入p53保守结合位点,分别将miR-138、miR-34a和miR-21前体序列pre-miR-138、pre-miR-34a和pre-miR-21插入上述改构的载体pCMV/p53-miR,将构建的pCMV/p53-miR-138、pCMV/p53-miR-34a和pCMV/p53-miR-21表达载体转染具有野生型p53的HeLa细胞和不表达p53的H1299细胞,分析p53对上述miRNA表达调控的影响。结果:转染改构的miRNA表达载体后,HeLa细胞中miR-138、miR-34a和miR-21的表达水平明显提高,它们对应的已知靶基因Cyclin D3、CDK2和PTEN的表达同时被显著下调。结论:在p53转录调控作用下,具有p53保守结合位点的miRNA表达载体能够更加有效地提高miRNA的表达水平;构建的载体不但可用于促进相关miRNA的表达,也能用于miRNA是否受p53调控的检测。     

牛肝菌属卷边组Boletus sect.Appendiculati物种的分子识别

依据牛肝菌属卷边组Boletus sect.Appendiculati内7个物种的核糖体基因rDNA内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)序列比对,设计5对ITS特异引物,分别用于卷边牛肝菌Boletus appendiculatus与亚卷边牛肝菌B.subappendiculatus、卷边牛肝菌与拟桃红牛肝菌B.pseudoregius、华靛牛肝菌B.roseoflavus与卷边牛肝菌B.appendiculatus、华靛牛肝菌与华美牛肝菌B.speciosus、拟桃红牛肝菌与华美牛肝菌的相互识别。ITS区段的PCR扩增结果表明,5对ITS特异引物皆成功扩增出可用于辨别这些近缘物种的目的条带。但未能设计出ITS特异引物,以识别华靛牛肝菌与桃红牛肝菌B.regius两个近缘物种。     

Vasorin基因稳定敲除HepG2细胞株的建立及其生物学功能研究

目的:利用CRISPR/Cas9技术建立人Vasorin(VASN)基因稳定敲除的HepG2细胞株,并研究VASN蛋白对细胞增殖和迁移等生物学功能的影响。方法:根据人VASN序列设计向导RNA,将其克隆至表达载体pCas-Guide,获得质粒pCas-gRNA;PCR扩增VASN编码基因左、右同源臂及潮霉素B抗性基因,通过重叠PCR将三者拼接为一条片段,并克隆至载体pBackZero-T,获得质粒pBackZero-T-VASN;上述2种重组质粒共转染HepG2细胞,经潮霉素B筛选,通过基因组PCR、RT-q PCR和Western印迹实验检测VASN基因是否被敲除。利用CCK-8法和Transwell法检测VASN稳定敲除细胞株的增殖和迁移能力。结果:向导RNA表达质粒pCas-gRNA和DNA供体质粒pBackZero-T-VASN构建成功;基因组PCR结果显示,潮霉素B基因正确重组至VASN基因中;RT-PCR显示VASN m RNA水平显著降低,Western免疫印迹结果显示VASN蛋白表达水平显著降低;VASN稳定敲除细胞株的增殖和迁移能力比野生型细胞明显减弱。结论:构建了pCas-gRNA和pBackZero-T-VASN质粒,获得了VASN缺失的细胞株,验证了VASN蛋白参与细胞的增殖和迁移过程,为深度探讨VASN的生物学功能及其分子机制奠定了基础。     

小鼠神经生长因子直接竞争酶联免疫检测方法的建立

目的:利用小鼠神经生长因子(mNGF)和纯化的兔抗mNGF IgG,建立mNGF直接竞争酶联免疫检测方法。方法:以亲和纯化兔抗mNGF IgG作为包被抗体,封闭、洗涤后加入用稀释液稀释的不同浓度的标准mNGF或样品液和生物素标记的mNGF混合液,于37℃孵育80 min或室温孵育120 min,洗涤后加入辣根过氧化物酶标记的链酶亲和素,洗涤后加入显色液显色,测定D450nm值,通过标准曲线计算待测样品中mNGF含量。结果与结论:建立了mNGF直接竞争酶联免疫检测方法;该方法的灵敏度约20 ng,变异系数为批内≤10%、批间≤15%,回收率为85%～115%;利用该方法检测了3批样品中mNGF的含量。     

人肿瘤坏死因子α抑制肽-抗炎酸性尾巴融合蛋白的原核表达及纯化

目的:表达和纯化人肿瘤坏死因子α抑制肽-抗炎酸性尾巴融合蛋白。方法:利用PCR搭接方法及基因合成方法获得目的基因,插入带有6×His标签的原核高效可溶性表达载体pET32a中,构建重组表达质粒pET32a-T9-ac-9,将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导目的基因表达;对融合蛋白进行Ni2+金属螯合柱纯化。结果:构建的重组表达质粒经PCR、内切酶鉴定及基因序列测定证实;目的蛋白在大肠杆菌中获得表达,SDS-PAGE显示相对分子质量为22.917×103;对表达产物进行了亲和层析纯化,从上清中获得了纯度较高的人肿瘤坏死因子α抑制肽-抗炎酸性尾巴融合蛋白。结论:获得了可溶性的人肿瘤坏死因子α抑制肽-抗炎酸性尾巴融合蛋白,为其生物学功能研究奠定了基础。     

Ku70基因稳定敲除HeLa细胞株的建立及其生物学功能研究

目的:利用CRISPR/Cas9技术构建人Ku70基因稳定敲除的HeLa细胞株,并检测其生物学功能。方法:设计并构建向导RNA载体p Cas-g RNA和同源重组供体DNA载体p Back Zero-T-Ku70,2种重组质粒共转染HeLa细胞,加入潮霉素B进行抗性筛选,通过基因组PCR和Western印迹检验Ku70基因是否被敲除;进而,选择Ku70稳定敲除的细胞株,分别采用CCK-8和Transwell实验检测细胞增殖和迁移能力;此外,提取细胞总RNA,反转录成c DNA后用荧光定量PCR仪检测5种miRNA(hsa-miR-649、hsa-miR-544a、hsa-miR-562、hsa-miR-548a、hsa-miR-492)的表达水平。结果:g RNA表达质粒p Cas-g RNA和DNA供体质粒p Back Zero-T-Ku70构建成功;2种重组质粒共转染HeLa细胞,基因组PCR扩增出特异的基因重组DNA片段,Western印迹结果显示Ku70蛋白已基本无表达。细胞增殖和迁移实验显示敲除Ku70基因的HeLa细胞增殖和迁移能力均有所减弱。q RT-PCR结果显示,敲除Ku70基因致hsa-miR-649、hsa-miR-544a和hsa-miR-562水平有所升高,而hsa-miR-548a和hsa-miR-492水平未有明显变化。结论:获得Ku70基因稳定敲除的细胞株;Ku70蛋白可能参与了HeLa细胞增殖和迁移过程;其还可能调节部分miRNA的表达。     

蛋白激酶C对胰岛素样生长因子—1促糖代谢作用的影响

为了研究蛋白激酶Ｃ（ＰＫＣ）在胰岛素样生长因子－１（ＩＧＦ１）促糖代谢过程中所起的作用,分别检测ＰＣＫ激动剂佛波醇酯（ＰＭＡ）和抑制剂星形孢菌素（Ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ）对ＩＧＦ１降糖作用的影响。结果表明ＰＭＡ和星形孢菌素分别能抑和增强ＩＧＦ１的降糖作用,建立了高表达ＰＫＣα的ＨｅｐＧ２细胞株,ＩＧＦ１对此细胞株的降糖作用与对照相比大大增强,ＰＭＡ和星形孢菌素分别可大大抑制和增强ＩＧＦ１对ＰＣ     

人胰岛素样生长因子Ⅰ在大肠杆菌中的表达研究

胰岛素样生长因子Ⅰ（ＩＧＦ－Ⅰ）是一种多功能细胞增殖调控因子,它对许多疾病有较好的治疗作用．为了获得大量的ＩＧＦ－Ⅰ产品,在测定了ＩＧＦ－Ⅰ全长序列的基础上,构建了ＩＧＦ－Ⅰ表达载体ｐＢＶＩＧＦ,经热诱导表达后,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析表明：含有重组表达质粒的菌株可表达出７．６ｋＤ的蛋白．研究了不同菌株对ＩＧＦ－Ⅰ表达的影响．ＩＧＦ－Ⅰ的表达水平可达１５ｍｇ／Ｌ．重组蛋白主要以包涵体形式存在,进行了初步纯化和复性研究,Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹表明重组蛋白具有ＩＧＦ－Ⅰ的抗原性．并初步建立了ＩＧＦ－Ⅰ生物活性测定方法．     

用于未纯化蛋白样品核酸适配体筛选的Western印迹-SELEX筛选技术的建立

目的:建立一种基于Western印迹的指数式富集的配体系统进化(SELEX)技术,用于未纯化蛋白样品核酸适配体筛选。方法:将目的蛋白经SDS-PAGE分离后转移到PVDF膜上,用生物素标记的ss DNA与PVDF膜上的蛋白共同孵育,获得能与靶蛋白特异结合的适配体,最后通过生物素-链霉亲和素-辣根过氧化物酶系统、基因克隆测序、MEME在线软件和RNAstructure软件分析适配体的一、二级结构,并对筛选得到的适配体进行鉴定。结果:经过4轮筛选,获得了能特异识别靶蛋白而不识别无关蛋白的适配体,原库Gp45则与上述蛋白均没有结合。结论:建立了Western印迹-SELEX技术,可用于未纯化蛋白样品核酸适配体筛选。