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1.
目的:通过基因克隆在巴斯德毕赤酵母中表达人自身抗原组氨酰转移核糖核酸合成酶(HRS或Jo-1)。方法:PCR扩增Jo-1基因,与酵母表达载体pPIC9k重组,构建表达质粒pPIC9k-Jo-1。用电穿孔法转化酵母菌SMD1168,在MD平板上筛选重组克隆,用G418快速筛选高拷贝转化子,阳性克隆经甲醇诱导表达后,培养上清用SDS-PAGE和免疫酶斑点法鉴定。结果:PCR产物长约1500bp,与预期1526bp接近;pPIC9k-Jo-1重组阳性克隆测序结果与GenBank核酸数据库的报道完全一致,双酶切鉴定正确,表达产物Jo-1的相对分子质量约55000,免疫酶斑点法证实表达产物具有天然Jo-1分子的免疫原性,阴性对照菌未见目的表达条带。结论:Jo-1在巴斯德毕赤酵母中分泌表达成功,为后续研究打下了基础。  相似文献
2.
膜渗滤亲和层析法纯化腹水单克隆抗体   总被引:2,自引:0,他引:2       下载免费PDF全文
用膜渗滤亲和层析法纯化腹水单克隆抗体(McAb).采用硝酸纤维素膜(NCM)作固相支持物吸附抗原,用负压使小鼠腹水渗滤NCM,在滤过的同时腹水中的McAb不断结合于NCM上吸附的抗原,再将McAb从NCM上解离,从而得到高纯度的McAb.用此法纯化抗白蛋白(Alb)McAb.结果提纯的Alb McAb纯度达PAGE电泳单条带,将此McAb点样NCM用于斑点免疫渗滤法(DIFA)检测Alb,其灵敏度比用腹水点样时高20倍.该法快速简便,可代替亲和层析柱用于纯化McAb.  相似文献
3.
金黄色葡萄球菌外毒素B特异性适体的筛选及其应用   总被引:1,自引:0,他引:1  
目的:利用指数富集配基的系统进化(SELEX)技术,筛选能与金黄色葡萄球菌外毒素B(SEB)特异、高亲和力结合的单链DNA(ssDNA)适体,并将该适体应用于患者血清标本的检测。方法:从体外合成的96核苷酸随机ss—DNA文库中,以羧基磁珠作为筛选介质,经逐步PCR扩增、筛选,获得针对SEB的高亲和力、高特异性适体;利用荧光素标记适体测定筛选过程中各轮结合力;利用酶连接适体方法检测适体特异性和结合力。结果:经过13轮筛选,ssDNA文库与SEB的结合百分率从1.1%提高到39.8%,增加了36倍;获得的ssDNA适体(A11)针对SEB的特异性强,与金黄色葡萄球菌表面蛋白A(SPA)结合低,并能初步识别患者血清。结论:利用SELEX技术筛选获得了特异结合SEB的高亲和力的ssDNA适体,为金黄色葡萄球菌的临床诊断与治疗奠定了基础。  相似文献
4.
灭活铜绿假单胞菌适体的筛选   总被引:1,自引:0,他引:1       下载免费PDF全文
 利用指数富集配基的系统进化(SELEX)技术,以灭活的铜绿假单胞菌为靶标,从体外合成的96 nt随机ssDNA文库中筛选与铜绿假单胞菌特异结合的适体.在第12轮和第14轮与其它假单胞菌属进行反筛策略,并进行了适体的结合亲和力的测定,再分别利用ClustalX、Mega2和Mfold sever软件分析适体的一级和二级结构.研究结果表明,经过15轮筛选,随机ssDNA文库与铜绿假单胞菌结合的A值从0.022上升到0.448.反筛与未反筛的结合A比值最高比为53倍.经过第15轮反筛后的24个阳性克隆子测序,根据软件分析,其可分成10个家族.每个家族都有其共同的保守序列(除第10个家族),其中有2条序列几乎完全一致(F23和F47),同源性达到97%,A值分别高达1.598和1.508,Kd为14.55和77.46 nmol/L,间接说明适体与铜绿假单胞菌的结合力明显增高.  相似文献
5.
筛选环孢霉素A适体的SELEX技术的建立   总被引:1,自引:0,他引:1       下载免费PDF全文
 体外合成一个全长78个核苷酸,中间含35个随机序列的随机单链寡核苷酸序列(ssDNA)文库,运用指数富集的配体系统进化(SELEX)技术,以环孢霉素A(CsA)为靶目标,以磁珠作为筛选介质,利用生物素 链酶抗生物素 辣根过氧化物酶系统,检测每轮ssDNA文库与CsA的亲和力,筛选并鉴定CsA特异性的适体.经过11轮的筛选,ssDNA文库与CsA的亲和力呈上升趋势.将第10轮筛选产物克隆测序并运用相关软件进行一级结构和二级结构分析.随机挑选的19个克隆适体,根据一级结构的同源性可分为5个家族,二级结构预测以茎环(发夹)为主,这可能是适体与CsA作用的部位. CsA特异性的适体将用于酶联法、免疫荧光法等对CsA进行检测.  相似文献
6.
目的:为建立新的自身抗体检测方法,自行克隆、表达和鉴定人自身抗原SmB'。方法:应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,从白血病淋巴细胞HL-60细胞株中克隆人自身抗原SmB'全长基因;将PCR产物直接进行TA克隆、鉴定及测序,再定向克隆至pGEX-5T载体中,转入大肠杆菌BL-21;阳性克隆经鉴定后在IPTG诱导下表达,产物行SDS-PAGE和Western印迹。结果:PCR产物长约700bp,与预期的657bp接近,测序结果与GenBank核酸数据库报道完全一致。pGEX-5T-SmB'重组阳性克隆酶切鉴定正确,SDS-PAGE和Western印迹结果显示融合蛋白相对分子质量为51000,具有天然人自身抗原SmB'的免疫原性。结论:克隆表达了人自身抗原SmB',为建立相应的自身抗体检测方法奠定了基础。  相似文献
7.
 信号适体兼具有分子识别和信号转导的功能.从随机寡核苷酸库中筛选出的适体,要经过合理设计和筛选后修饰,才具备信号转导功能.信号适体可分为标记和非标记两大类.本文着重介绍荧光标记信号适体的设计策略,包括基于荧光偏振分析标记一个荧光基团,及基于荧光共振能量转移同时标记荧光基团、淬灭基团,或两个荧光基团的信号适体(包括分子信标适体、结构转换和原位标记信号适体).非标记信号适体的设计,有嵌合法、置换法、光转换复合物法,及适体-多聚物偶联法.此外,亦可直接从体外筛选出信号适体.信号适体的诸多优点利于其用于生物传感器及均相液相中实时蛋白识别与定量分析.  相似文献
8.
采用SDS PAGE、等电聚焦、脱磷酸反应、蛋白质N端氨基酸测序、KPTT及大鼠下腔静脉血栓形成观察 ,发现毕赤酵母重组Annexin32的分子特征较原核产物有了明显变化。有主、次 2条带 ,主带的分子量比原核产物大 ,等电点较理论值低 ,已被磷酸化 ,2条带的N端均携带了来自载体的 4个氨基酸 ,可能对其与活化血小板表面磷脂的结合有所下调 ,导致血凝与血栓形成受到一定的影响 ,但仍具有明显的抗凝及抑制血栓形成作用。  相似文献
9.
免疫调节制剂的靶目标为免疫系统相关分子如细胞因子、共刺激分子等,在治疗自身免疫病中很有潜力。免疫调节制剂的生产需要合适的表达系统,而毕赤酵母系统具有便于基因操作、易培养和高密度发酵等特征;更重要的是,毕赤酵母为真核细胞,可进行翻译后修饰并分泌可溶性的正确折叠的重组蛋白,其生物活性及功能也得到相应提高,这些优势使得毕赤酵母成为高效实用的蛋白表达宿主。我们就毕赤酵母系统表达的用于治疗自身免疫病的几种免疫调节制剂的研究进展做简要综述。  相似文献
10.
细胞极性是指细胞形态、蛋白分布以及细胞功能的不对称性,它是细胞发育、维持项一底极性、损伤修复及组织完整性等生理过程所必需的,主要是由极性蛋白调控。一旦极性蛋白之间的平衡失调,则会破坏细胞极性,诱导肿瘤发生、增殖及迁移。研究表明,极性蛋白的异常表达及错误定位均与肿瘤紧密相关。上皮细胞肿瘤发生及恶性转变过程通常伴有细胞极性丢失以及组织结构紊乱的现象,尤其是经历上皮间充质转变的上皮肿瘤细胞更易侵袭周围基质,最终引发转移。作者就目前有关极性蛋白在肿瘤方面的研究作一综述,重点阐述极性蛋白在肿瘤转移中的功能,并对相关问题进行讨论。  相似文献
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