Red/ET 同源重组介导细菌人工染色体的快速修饰

随着基因组测序工程的实施与完成,如何对包含完整基因信息的特定细菌人工染色体 (BAC) 进行有目的修饰,已成为功能基因组学研究的一个重要环节 . 应用新近优化的 Red/ET 同源重组技术对目标 BAC 进行修饰,以 pSC101-BAD-gbaA 为依托质粒,采用 rpsL-neo 为正 / 反向筛选系统,可以快速、高效地对 BAC 进行剪切、插入、替换等操作,其中能够进行抗性筛选的一步 BAC 修饰只需一周时间,以插入非抗性标记基因 Cre 为代表的两步 BAC 修饰在两周内即可完成 . 通过阿拉伯多糖诱导调控和简单地变化培养温度,能使 pSC101-BAD-gbaA 依托质粒在发挥完 Red/ET 同源重组作用后自然消失,最终获得完整而纯净的修饰后 BAC ,为加快功能基因组学研究提供了一个可靠的实验平台 .     

五种假单胞菌的分离鉴定及其生物活性

【目的】从湖南长沙市采集到的土样中分离假单胞菌并进行归类,研究各菌株抑菌和抗肿瘤生物活性,以丰富假单胞菌菌种资源并为微生物次级代谢物的挖掘奠定基础。【方法】采用大蜡螟诱集法诱集分离假单胞菌,结合形态观察、生理生化特征和16S rRNA基因序列同源性分析,鉴定并归类各细菌,通过平板扩散法、对峙培养法和肿瘤细胞毒性试验分别研究各菌株抑制细菌、拮抗真菌和抗肿瘤细胞等生物活性。【结果】从湖南长沙市郊区菜地、林地中分离得到5株假单胞菌,归类并命名为Pseudomonas protegens CY01、绿针假单胞菌CY02(Pseudomonas chlororaphis CY02)、栖稻假单胞菌CY04(Pseudomonas oryzihabitans CY04)、Pseudomonas sp.CY05和恶臭假单胞菌CY06(Pseudomonas putida CY06)。P.protegens CY01和P.chlororaphis CY02对枯草芽胞杆菌(Bacillus subtillis)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)具有较好的抑菌效果,P.chlororaphis CY02对水稻稻瘟病菌(Pyricularia oryzae)具有良好的拮抗作用,对小鼠黑色素瘤细胞B16具有较强的细胞毒性。【结论】分离得到的P.chlororaphis CY02,在抑制病原细菌、拮抗水稻稻瘟病菌和抗肿瘤细胞等方面具有显著效果。     

sTRAIL蛋白原核表达载体的构建、表达及抗肿瘤活性研究

目的:从HL-60细胞中获得了sTrail基因片段,优化蛋白表达条件,并研究其抗肿瘤活性。方法:培养HL-60细胞,提取总RNA,通过RT-PCR扩增sTRAIL蛋白基因片段,并将目的基因克隆至原核表达载体p ET28a上,并电击转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,优化蛋白表达条件,Ni-IDA柱纯化重组蛋白,SDS-PAGE蛋白电泳,胶内酶解质谱鉴定。纯化后的重组蛋白作用HUVEC,He La,Hep-3B,HCT-116,MDA-MB-231,H460细胞检测蛋白生物学作用。结果:DNA测序结果证实成功构建了重组质粒p ET28a-sTrail,SDS-PAGE蛋白电泳,胶内酶解质谱检测显示成功表达sTRAIL蛋白,MTT法和流式细胞术结果显示,sTRAIL蛋白对肿瘤细胞包括He La,HCT-116,MDA-MB-231,H460,Hep-3B细胞有良好的生物活性,对正常的HUVEC细胞无毒性。结论:成功构建可以高效表达sTRAIL蛋白的原核表达载体,优化蛋白的表达和纯化后所得sTRAIL蛋白具有良好的抗肿瘤生物活性,为研究和发展利用sTRAIL蛋白作为临床治疗抗肿瘤药物提供了重要基础。     

牛乳铁蛋白素及其衍生物的研究进展

牛乳铁蛋白素是牛乳铁蛋白经胃蛋白酶水解后释放出来的一段小肽,是牛乳铁蛋白的活性中心。通过对不同动物来源乳铁蛋白素活性的研究发现牛乳铁蛋白素的抗菌活性最强。进一步的丙氨酸突变实验研究表明,在牛乳铁蛋白素活性最强的15个氨基酸序列中,色氨酸在抗菌过程中起着重要作用。牛乳铁蛋白素正是因为含有两个色氨酸,其活性才会比只含有一个色氨酸的其它来源的乳铁蛋白素活性要高。很多实验室围绕着牛乳铁蛋白素中的色氨酸、碱性氨基酸和其他一些芳香族氨基酸展开了一系列的突变研究,本文综述了这些研究及在氨基酸改变后活性的变化,为以后研究及开发牛乳铁蛋白素提供理论基础。     

三种淡水鱼类在中国南北两个地区的肠道菌群差异比较

山东省德州市禹城市和湖南省长沙市望城区分别属于我国北方和南方地区,环境和气候差异明显。本试验以禹城市和望城区两地的草鱼(Ctenopharyngodon idella)、鲫鱼(Carassius auratus)和鲤鱼(Cyprinus carpio)为研究对象,对肠道中的菌群进行16s rRNA V4高变区扩增,基于IonS5 TM XL测序平台进行测序,并对相关数据进行分析。结果表明,在门水平上鲫鱼、鲤鱼、草鱼的肠道优势菌主要为变形菌门(Proteobacteria)、梭杆菌门(Fusobacteria)、硬壁菌门(Firmicutes),拟杆菌门(Bacteroidetes),各组中这四种菌门所占比之和均在80%以上;基于Bray-Curtis距离值的秩次进行组间差异显著性检验,山东草鱼组和湖南草鱼组比较中组间差异大于组内差异(R=0.307,P<0.05),且线性判别分析显示湖南草鱼组的特征性菌群为弧菌属,而山东草鱼组的为梭菌纲,推测特征性菌群差异与环境的影响有关;有害菌种的统计分析表明,湖南鲫鱼组和鲤鱼组的嗜水气单胞菌属相对丰度明显高于对应的山东鲫鱼组和鲤鱼组,山东草鱼组和鲤鱼组的弧菌属相对丰度高于对应的湖南草鱼组和鲤鱼组,可能受外界环境的影响,不同地区抵御外来有害细菌的能力也不一样。本研究对两地的淡水鱼类肠道微生物群落结构进行了比较和分析,为进一步的鱼类发育研究奠定基础。     

脂肪酶lipAB操纵子在防御假单胞菌中的克隆、表达及活性研究

对荚壳伯克氏菌PG1(Burkholderia glumae PG1)基因组中的脂肪酶操纵子lipAB片段进行直接克隆,构建含有脂肪酶基因的分泌表达载体,实现其在防御假单胞菌Pf-5(Pseudomonas protegens Pf-5)中的异源表达,并研究重组工程菌的胞外脂肪酶活性。利用Red/ET直接克隆技术获得克隆载体p15A-cm-lipAB;再通过亚克隆技术构建重组表达载体pBBR1-km-lipAB和pBBR1-km-Papra-lipAB,将这两个表达载体分别电转至Pf-5中,通过卡那霉素或者阿伯拉霉素抗性筛选得到转化子,以三丁酸甘油酯平板扩散法和对硝基苯酚法检测脂肪酶酶活,并通过实时荧光定量PCR检测启动子的替换对lipA表达的影响。本研究从PG1中成功克隆了脂肪酶操纵子lipAB(GenBank accession number:AJK49931. 1 and AJK49932. 1);成功构建了重组工程菌Pf-5/pBBR1-km-lipAB和Pf-5/pBBR1-km-Papra-lipAB,并成功检测到两株工程菌的胞外脂肪酶活性;以LB培养基培养至24 h时,启动子优化后lipA基因表达量是原始水平的2. 1倍;在LB培养基摇瓶发酵至66 h时,Pf-5/pBBR1-km-lipAB的脂肪酶酶活最高且为13. 51 U/mL,而Pf-5/pBBR1-km-Papra-lipAB的酶活为46. 85 U/mL,是Pf-5/pBBR1-km-lipAB的3. 47倍。初步实现基因lipA在Pf-5中的表达,发现组成型启动子Papra比lipAB的原始启动子PlipAB效率更高,为将来实现规模化生产奠定了技术基础。     

发光杆菌TT01中Tc毒素复合体基因簇的直接克隆

本研究通过NCBI数据分析得知Photorhabdus luminescens TT01基因组中表达Tc毒素蛋白复合体的基因簇包含了6个相关的Tc毒素基因,分别为tcaZCB(plu0514-0515)、tccAB3(plu0805-0806)、tccAB1(plu4165-4169)、tcd(plu0960-0971)、tccC4(plu0976)和tccC7(plu4488)。利用Red/ET直接克隆技术,快速获得发光杆菌TT01基因组DNA上的4个Tc毒素基因tcaZCB(6 804 bp)、tccAB3(7 419 bp)、tccAB1(10 954 bp)和tcd(51 406 bp)分别构建到相应的重组质粒p15A-cm-tcaZCB、p15A-cm-tccAB3、p15A-cm-tccAB1和p15A-cm-tcd上。通过PCR技术分别扩增得到tccC4基因(2 891 bp)和tccC7基因(2 871 bp),并进行T载体连接后,分别获得质粒pMD18-tcc4和pMD18-tcc7。本研究通过两种不同的生物技术方法成功克隆到发光杆菌TT01基因组上的Tc毒素蛋白复合体的所有相关基因,为后续的研究打下一定的基础。     

RED同源重组法敲除发光光状杆菌晶体蛋白基因cipA和cipB

RED同源重组法敲除发光光状杆菌晶体蛋白基因cip和cipB,为发光光状杆菌基因敲除提供方法.采用TOPO克隆方法将基因cipA和cipB克隆到质粒pTA上,获得质粒pTA-cipA和pTA-cipB;采用Red/ET方法分别将Gentd基因和Aprd基因分别插入pTA-cipA和pTA-cipB的cipA和cipB基因中,并替换cipA和cipB基因部分序列,获得pTA-GentaIncipA和pTA-ApraIncipB;pTA-GentaIncipA通过BamH Ⅰ酶切,从0.7%琼脂糖胶上回收获得GentaIncipA,将GentaIncipA导入带有质粒pASK-αβγA的P luminescens subsp.Akhurstii中,通过的RED同源重组敲除发光光状杆菌晶体蛋白cipA:pTA-ApraInciB用EcoR Ⅰ酶切,从0.7%琼脂糖胶上回收获得ApraIncipB,将ApraIncipB导入带有质粒pASK-αβγA的P.luminescens subsp.Akhurstii中,通过的RED同源重组敲除发光光状杆菌晶体蛋白cipB;42℃下热激去除突变菌中的质粒pASK-αβγA.克隆PCR和SDS-PAGE电泳结果表明发光光状杆菌晶体蛋白基因cipA和cipB均被敲除.采用RED同源重组法成功地敲除了发光光状杆菌晶体蛋白基因cipA和cipB.     

DNA改组的最新动态及应用前景

DNA改组(DNA shuffling)是目前最方便、有效的一种分子水平的体外定向进化技术,该技术同倾向错误PCR (Error-prone PCR) 相结合,通过对单基因或相关基因家族的靶序列进行多轮随机诱变、重组和高通量的筛选,可以有效富集正突变,去除负突变,提高突变文库的丰度,创造新基因和获得期望功能的蛋白质。DNA改组技术已在新药物等领域取得了广泛的应用,极大地推动了现代生物科学和生物技术的发展。该技术同计算机强大的数据分析系统相结合,将会为后基因组学的发展提供强有力的技术平台。     

噬菌体重组酶介导的DNA同源重组工程

来源于噬菌体的遗传操作工具在基因工程中具有非常重要的地位,例如位点特异性重组酶、柯斯质粒DNA文库及同源重组酶等。其中,来源于lambda噬菌体的同源重组酶Redα/Redβ和来源于Rac原噬菌体的同源重组酶RecE/RecT能够高效地介导35–50 bp短同源臂之间的重组。基于噬菌体同源重组酶Redα/Redβ和RecE/RecT开发的DNA同源重组工程（Recombineering）能够对靶标DNA分子进行快速、精准、高效的修饰,不受限制性内切酶识别位点和DNA分子大小限制,已发展成为一种新型的基因工程技术。本文主要综述了噬菌体同源重组酶及其作用机制、在大肠杆菌及其他细菌中的应用和开发,以及在微生物次级代谢产物的挖掘、动植物转基因、病毒基因组克隆和修饰等方面的应用。原位激活沉默基因簇需要宿主特异性的DNA同源重组工程进行启动子和调控元件的修饰;异源表达次级代谢产物的首要步骤一般是通过RecET直接克隆大的DNA片段;动植物转基因复杂载体的构建效率在有了Red同源重组系统以后有了革命性的发展;RecET直接克隆和Red同源重组介导的感染性克隆构建和修饰方法,不仅有利于病毒基因组功能研究,同时也为载体疫苗开发提供了最优方案。