猴副流感病毒SV5的PCR检测方法建立及初步应用

[目的]建立检测SV5的PCR方法并加以初步应用。[方法]根据Genbank中报道的SV5序列,针对其中的SH基因设计引物进行PCR反应,扩增产物进行测序并用BLAST软件进行同源性比对,同时利用限制性内切酶的酶切反应以证实此PCR反应的特异性。在此基础上设计巢式PCR提高此方法的灵敏度。利用此方法对20份猴肾源细胞培养物和40份血清标本进行检测。[结果]利用设计的引物扩增出的序列测序结果证实与报道的SV5SH基因相对位置的序列一致。AccIII限制性内切酶可对PCR产物进行特异性酶切。巢式PCR比一次PCR的敏感度有所提高。用此方法检测的20份猴肾源细胞培养物和40份血清标本结果为阴性。[结论]本文首次初步建立了检测SV5病毒的PCR方法,排除实验室用20份猴肾源细胞培养物和40份血清标本SV5的污染。     

PCR技术在猴免疫缺陷病毒(SIV)感染模型中的应用

目的(1)建立RT PCR方法,定性测定SIV感染猴血浆中病毒RNA,比较其与传统血浆病毒分离方法的敏感性;(2)建立DNA PCR方法,检测SIV感染猴外周血淋巴细胞(PBMCs)中的前病毒DNA。(3)检验DNA PCR和RNA PCR方法在猴SAIDS模型应用中的实用性和可操作性。方法用SIVmac251静脉感染恒河猴,定期采血,从血浆中提取病毒RNA,以RNA为模板通过RT PCR法扩增,凝胶电泳定性;从感染猴PBMC中提取带有整合的SIV前病毒DNA的细胞基因组DNA,巢式PCR扩增,凝胶电泳定性。结果DNA PCR和RNA PCR经两轮扩增后均得到一长度为477bp的特异条带,测序鉴定确为目的片段。9只实验猴感染SIV后7d,RNA PCR结果为79阳性,DNA PCR结果为100%阳性,而血浆病毒分离只有59阳性;此后一直到感染后的42d,RNA PCR和DNA PCR的结果一直为100%阳性,而血浆病毒分离阳性率在感染后35d下降到49,到42d时下降为零。结论PCR方法比病毒分离方法的敏感性高。尤其是DNA PCR,既可检测具有活跃病毒复制的受感染细胞,又可检测那些携带病毒处于转录休眠期的细胞,所以在感染的早期和中后期———血浆病毒水平较低的情况下或病毒处于潜伏感染的阶段,它作为猴艾滋病(SAIDS)模型病毒学指标之一有其必要性和重要性。这个指标的检测方法应该是较血浆病毒RNA检测更为敏感。     

北京地区养殖果子狸SARS冠状病毒调查

目的调查北京地区养殖果子狸SARS病毒感染和携带情况。方法用PCR方法检测果子狸咽拭子、肛拭子和皮毛标本,进行SARS病毒病原检测;中和抗体检测果子狸血清。结果本次抽样检测北京地区3个养殖场的10%的果子狸,未检测到SARS冠状病毒,血清抗体阴性。结论检测结果不支持北京地区饲养的果子狸中携带有SARS冠状病毒。     

藜蒿的组织培养和快速繁殖研究

通过组织培养技术可以诱导藜蒿的幼叶和茎段产生愈伤组织和植株.研究表明,MS NAA 0.5 mg/L 6-BA 0.5 mg/L(蔗糖3%)最适合诱导藜蒿的叶片、茎段形成愈伤组织以及愈伤组织分化成再生植株,而MS NAA 0.5 mg/L最适合外植体诱导生根,1/2MS培养基对幼苗的生根作用十分明显.再生植株水培试验,筛选出了适合于藜蒿工厂化生产的营养液.     

肺结核全基因组关联研究进展

肺结核是由结核分枝杆菌感染引起的一类古老但仍对人类造成巨大影响的传染性疾病。到目前为止, 肺结核依然是由单一病原菌导致死亡人数最多的疾病, 并且随着耐药菌株的出现而呈现死灰复燃之势。近几年, 肺结核全基因组关联研究在世界范围内取得了阶段性成果, 发现了与肺结核相关联的遗传易感位点和区域, 使肺结核的遗传学研究进入了一个崭新的阶段, 为后续肺结核的早期和综合防治提供了重要线索。然而, 由于人群遗传结构差异和宿主/病原体相互作用, 与其他复杂疾病相比, 肺结核全基因组关联研究依旧面临重重困难, 进展缓慢。文章对不同人群肺结核全基因组关联研究及其验证进行综述, 并系统阐述了目前研究中存在的困难及可能的应对策略。     

H2O2对蛇足石杉离体培养物诱变效应的研究

为了获得高产石杉碱甲(Huperzine A,Hup A)的蛇足石杉[Huperzia serrata(Thunb.)Trev.]叶状体,对H_2O_2诱变后的叶状体进行了研究。结果表明,诱变后叶状体株系的Hup A含量显著提高,并获得高产株系SH42,其相对生长率和Hup A含量分别达到4499.28%和261.17μg g~(–1) DW,比起始叶状体分别提高了2.35倍和2.43倍;且株系间可溶性蛋白质谱带和SOD同工酶谱均存在差异,经过连续9代培养,变异叶状体可以稳定遗传。因此,H_2O_2对叶状体细胞具有良好的诱变效应,可以用于筛选高产Hup A株系。     

SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR测定猴免疫缺陷病毒RNA拷贝数方法的建立

目的 建立SYBR Green Ⅰ荧光染料实时定量RT-PCR方法,测定猴免疫缺陷病毒(SIV)RNA拷贝数.方法 巢式RT-PCR扩增SIV病毒RNA gag基因上1360-1837之间的长度为477 bp的片段,将该片段克隆到pGEM T载体上,构建pGEM-SIVgag477质粒.该质粒经限制性内切酶Not I酶切后,进行体外转录,转录出的RNA产物(RS)纯化后10倍系列稀释,作出标准曲线,作为SIV病毒RNA荧光定量检测的外标准品.结果 应用Qiagen公司QuantiTect SYBR GREEN RT-PCR Kit,该标准品可精确定量到100 copies/μL.结论 制备的RS外标准品纯度高,SYBR Green Ⅰ荧光染料实时定量RT-PCR法特异性、敏感性高,稳定性好,可用于定量测定猴免疫缺陷病毒(SIV)RNA拷贝数.     

SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR测定猴免疫缺陷病毒RNA拷贝数方法的建立

目的建立SYBR Green I荧光染料实时定量RT-PCR方法,测定猴免疫缺陷病毒(SIV)RNA拷贝数。方法巢式RT-PCR扩增SIV病毒RNAgag基因上1360-1837之间的长度为477 bp的片段,将该片段克隆到pGEMT载体上,构建pGEM-SIVgag477质粒。该质粒经限制性内切酶NotⅠ酶切后,进行体外转录,转录出的RNA产物(RS)纯化后10倍系列稀释,作出标准曲线,作为SIV病毒RNA荧光定量检测的外标准品。结果应用Qiagen公司QuantiTect SYBR GREEN RT-PCR Kit,该标准品可精确定量到100 copies/μL。结论制备的RS外标准品纯度高,SYBR Green I荧光染料实时定量RT-PCR法特异性、敏感性高,稳定性好,可用于定量测定猴免疫缺陷病毒(SIV)RNA拷贝数。     

小麦TaPSG719基因启动子的分离及序列分析

TaPSG719基因是从小麦中分离的花粉特异性表达基因,其功能未知.克隆和分析该基因的启动子有助于研究该基因的功能,解析小麦花器官的发育调控机制.本研究根据已报道的TaPSG719基因cDNA序列为基础设计引物,经过两次反向PCR获得了该基因起始密码子上游1776 bp的调控序列.应用PLACE和PlantCARE数据库系统对该序列进行分析研究,发现其具有启动子的基本元件TATA-box和CAAT-box、两种花粉特异性调控元件AGAAA和GTGA及光反应和激素响应元件.