地衣芽孢杆菌原生质体的制备、再生及转化研究

目的：提高地衣芽孢杆菌原生质体的产量和形成率,为进一步提高原生质体转化率打下基础。方法：通过酶解法对地衣芽孢杆菌工业生产菌株Bacillus licheniformis303原生质体的制备及再生条件进行了研究。考察了菌体生长状态、溶菌酶浓度、处理时间、渗透压稳定剂和再生培养基等因素对地衣芽孢杆菌原生质体的制备及再生的影响。结果：对数生长后期的菌体,以SMMP作渗透压稳定剂,溶菌酶浓度为100mg/mL,37℃下酶解30min,原生质体生成量可达8×109个/mL;再生培养基选用含1mol/L琥珀酸钠的DM3时,再生率最高可达17%。在此条件下,采用PEG法将游离型质粒pHY-P43-secQ转化宿主菌B.lichenifor-mis303,转化率可达10~15 CFU/μg DNA。     

构建羰基还原酶基因工程菌生物转化产l-麻黄碱

以筛选得到的Morganella morganii J-8细菌的基因组为模板,通过PCR扩增得到目的基因mdlh2。核苷酸序列测定结果表明,基因全长1046bp。以pET28a（＋）为表达载体,构建重组质粒pET28a（＋）-mldh2,并在E．coli BL21（DE3）中表达。利用表达产物进行生物转化,发现其具有催化底物1-苯基-2-甲氨基丙酮（简称MAK）产l-麻黄碱的活力。进一步考察了诱导时间和IPTG浓度对重组菌表达的羰基还原酶的影响,37℃下用0．5mmoL／L的IPTG诱导4h,重组羰基还原酶的酶活达到0．2U／mg蛋白,转化液中l-麻黄碱质量浓度达到45mg／L。     

粗糙脉孢霉酸性蛋白酶基因的克隆与鉴定*

以粗糙脉胞霉CICIM F00021染色体DNA为模板,通过PCR扩增得到粗糙脉胞霉酸性蛋白酶结构基因。对其序列进行了测定和分析,表明扩增得到的片段为酸性蛋白酶基因。将扩增出的酸性蛋白酶基因克隆入酵母表达载体中获得重组质粒pPIC9K-ap。将其转化入毕赤氏酵母获得重组菌NA3。重组酸性蛋白酶在pH4·0和45oC下表现出最高活性。     

红曲霉不同转化方法比较

为了研究红曲霉聚酮体途径,考察和比较了4种不同的转化方法以建立有效的红曲霉遗传转化系统。以潮霉素作为抗性筛选标记,pBC-Hygro作为转化载体,用基于原生质体的传统转化和电击转化、基于萌发孢子的电击转化以及REMI技术转化红曲霉。发现基于萌发孢子的电击转化由于转化率极低而不适于红曲霉转化。基于原生质体的传统转化和电击转化尽管每微克DNA分别能获得135个转化子和125个转化子,但因转化子稳定性差也适合红曲霉转化的转化。应用REMI技术,转化率提高约20倍,每微克DNA 2500个转化子,70%～75%的转化子的稳定,非常适合于红曲霉的转化。      

碱性β-甘露聚糖酶基因异源表达的研究

亚克隆的碱性β-甘露聚糖酶基因(man)来源于嗜碱芽孢杆菌N16-5,构建了大肠杆菌-枯草芽孢杆菌诱导型表达质粒pDG-man,在大肠杆菌JM109中获得了活性表达,经0.5 mmol/L的IPTG诱导后,可表达5 U/mL碱性β-甘露聚糖酶。重组大肠杆菌DE3-RIL(pDG-man)表达β-甘露聚糖酶水平是大肠杆菌JM109(pDG-man)的2倍。重组枯草芽孢杆菌WB600(pDG-man)可表达19.2 U/mL碱性β-甘露聚糖酶。     

以Zeocin Candida抗性基因为选择标glycerinogenes记的遗传转化

为从分子水平上阐释产甘油假丝酵母（Candida glverinogenes）高产甘油机理,建立一种方便可行的遗传转化系统是十分必要的。与G418和潮霉素等抗生素相比,Zeoein抗生素对C．glycerinogenes具有较低的致死浓度。以pGAPZb作为构建整合载体的骨架,以Zeocin抗性基因作为选择标记,以URA3基因作为整合位点,构建了C．glycerinogenes整合载体pGA-CU。整合载体经过限制酶线性化后用作转化载体,基于电击转化的方法成功获得了抗Zeocin的转化子并经过PCR分析进一步确证。通过优化电击转化的参数,获得了较为稳定的转化效率,基于这一技术的转化效率每微克DNA可获得120个转化子。为进一步研究该菌株的遗传背景和代谢机理奠定了基础。     

便于抗性基因分离和分子重组的系列质粒的构建

在分子克隆实验中,选择性标记特别是抗生素抗性标记是最常用和不可或缺的分子材料。为便于实验室获得和使用携带有不同末端序列的选择性标记,以质粒pBlueScriptSK(-)为基础,构建了分别携带有卡那霉素、博莱霉素、红霉素、潮霉素和庆大霉素等抗性基因的系列质粒pSKsymKm、pSKsymBle、pSKsymEry、pSKsymHyg和pSKsymGm。通过限制性酶切和胶回收技术,可以从上述构建的质粒中方便地获得带有理想接头的抗生素抗性基因。     

产甘油假丝酵母甘油代谢关键酶的研究

本文对产甘油假丝酵母的甘油代谢关键酶进行了研究,发现产甘油假丝酵母同化甘油能力极弱,少量葡萄糖明显改善其同化甘油的能力;线粒体3磷酸甘油脱氢酶受3磷酸甘油的强烈诱导,受葡萄糖代谢的阻遏。在甘油发酵过程中,产甘油假丝酵母胞浆3磷酸甘油脱氢酶酶活处于较高水平并在36h和60h时出现两次酶活高峰,其中第一次酶活峰值水平决定产甘油假丝酵母的甘油合成和积累水平,成为甘油高速积累期(18～48h)甘油合成的关键性的限速酶。在甘油发酵18～48h内,3磷酸甘油酯酶的酶活处于高水平,并在36h时出现酶活峰值;处于缓慢甘油积累阶段的48～72h间,3磷酸甘油酯酶已处于低水平表达,此时,3磷酸甘油酯酶则成为甘油合成的限速酶。产甘油假丝酵母稳定并高表达其胞浆3磷酸甘油脱氢酶基因并且其所表达的3磷酸甘油酯酶酶活远高于胞浆3磷酸甘油脱氢酶这一特征是其高产甘油根本所在。     

基因芯片技术在微生物学研究中的应用

近年来,基因芯片技术的诞生使得在一个实验中就可以同时对成千上万个基因进行转录水平的表达和DNA同源性分析成为可能。该项技术已被应用于揭示许多微生物体的转录表达和基因组的差异,随着越来越多的微生物基因组全序列测定的完成,基因芯片正逐渐成为许多微生物学研究领域中的一项常规技术。归纳了该技术在微生物生理,致病性,流行病学,生态,进化,代谢工程及发酵优化等研究中的应用。     

二(口恶)(口英)的危害

二(口恶)(口英)(dioxin)是含氯的化合物的俗称.其全称为多氯二苯并--对--二(口恶)(口英),呈无色针状晶体.对二(口恶)(口英)化合物的测定研究,根据其分子中氯原子的不同位置和数目能产生200多种异构体,但它的许多化学性质至今仍未完全确定,在750℃以上高温下才会快速分解.