近平滑假丝酵母(R)-羰基还原酶在大肠杆菌中的外泌表达及高效转化(R)-苯基乙二醇

克隆了近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)(R)-羰基还原酶基因rcr,构建胞外表达工程茵Escherichia coli BL21(DE3)/pET20b-rcr,实现了(R)-羰基还原酶在大肠杆菌中高效外泌表达,周质空间和发酵液酶的比活力分别达0.68 U/mg和0.26 U/mg,与大肠杆菌的胞内体系重组酶相比,酶的比活力提高了近两倍。为了更好地促进该重组酶的外分泌于大肠杆菌细胞外,通过添加温和型化学渗透剂甘氨酸,改善细胞壁的透性,(R)-羰基还原酶的活力提高至1.99 U,与添加甘氨酸前相比,酶活力提高了12.4倍,比活提高了4.3倍。浓缩后的发酵液催化2-羟基苯乙酮,产生(R)-苯基乙二醇,产率为88.1%,e.e.值为93.9%。与胞内重组酶相比,产率和光学纯度分别提高了44.4%和15.9%。本研究通过构建(R)-羰基还原酶的大肠杆菌分泌表达体系,大幅度提高了(R)-羰基还原酶的比活和生物转化手性醇的效率。     

Mutational Analysis of the Absolutely Conserved B8Gly： Consequence on Foldability and Activity of Insulin

B8Gly is absolutely conserved in insulins during evolution. Moreover, its corresponding position is always occupied by a Gly residue in other members of insulin superfamily. Previous work showed that Ala replacement of B8Gly significantly decreased both the activity and the foldability of insulin. However, the effects of substitution are complicated, and different replacements sometimes cause significantly different results. To analyze the effects of B8 replacement by different amino acids, three new insulin/single-chain insulin mutants with B8Gly replaced by Ser, Thr or Leu were prepared by protein engineering, and both their foldability and activity were analyzed. In general, replacement of B8Gly by other amino acids causes significant detriment to the foldability of single-chain insulin： the conformations of the three B8 mutants are essentially different from that of wild-type molecules as revealed by circular dichroism; their disulfide stabilities in redox buffer are significantly decreased; their in vitro refolding efficiencies are decreased approximately two folds; the structural stabilities of the mutants with Set or Thr substitution are decreased significantly, while Leu substitution has little effect as measured by equilibrium guanidine denaturation. As far as biological activity is concerned, Ser replacement of B8Gly has only a moderate effect： its insulin receptor-binding activity is 23% of native insulin. But Ttir or Leu replacement produces significant detriment： the receptorbinding potencies of the two mutants are less than 0.2% of native insulin. The present results suggest that Gly is likely the only applicable natural amino acid for the B8 position of insulin where both foldability and activity are concerned.     

基因多形性与抗心力衰竭药物疗效

临床上常用的一种通过阻断β受体的抗心衰药物只对50％的病人有效。基因研究发现,β受体基因多形性与该药物的疗效有关。在人群中,β受体基因有两种常见表型,一种表型表达的受体在蛋白结构的特定部位含精氨酸,另一种表型表达的受体在蛋白结构的这一部位含有的是甘氨酸。每个人从父母那里遗传两套基因,因此人们有的有两条合成含精氨酸受体的基因;有人有两条合成含甘氨酸受体的基因;还有人有一条合成含精氨酸受体的基因,一条合成含甘氨酸受体的基因。将人的合成含精氨酸受体的基因转给小鼠,这种小鼠不仅易于发生心衰,而且对β受体阻断剂反应好。     

烟草富含甘氨酸RNA结合蛋白在大肠杆菌中的表达

目的:克隆烟草富含甘氨酸RNA结合蛋白基因(glycine-rich RNA-binding protein,GRRBPs)并进行原核表达,为制备抗体和研究烟草抗逆性分子机理打下基础。方法:从总RNA中反转录扩增并克隆烟草富含甘氨酸RNA结合蛋白NtRGP-1a和NtRGP-3全长cDNA,将cDNA序列克隆到表达载体pGEX4T-1上,构建了重组表达质粒pGEX4T-1/NtRGP-1a、pGEX4T-1/NtRGP-3,转化大肠杆菌rosetta,IPTG诱导表达,GSTrap 4B亲和层析柱对重组蛋白进行纯化。结果:重组蛋白在大肠杆菌中可以高效表达,SDS-PAGE显示其相对分子质量与预计大小一致,蛋白纯度占总蛋白的95%以上。结论:成功克隆和表达了烟草富含甘氨酸RNA结合蛋白NtRGP-1a和NtRGP-3基因序列,为制备抗体和烟草抗逆性分子机理等进一步的研究奠定了基础。     

不同晶型甘氨酸在水中溶解度的测定与关联

不同晶型甘氨酸溶解度的测定对研究甘氨酸结晶及多晶型现象具有重要意义。采用激光动态法测定了15~80℃范围内α型和γ型甘氨酸在纯水中的溶解度数据,并且采用Apelb lat溶解度经验方程对实验数据进行了关联,回归了溶解度经验方程的参数,关联效果令人满意。实验结果表明,在水中α和γ甘氨酸溶解度均随温度升高而变大;在相同温度下,热力学亚稳的α型甘氨酸比稳态的γ型甘氨酸溶解度大。     

安普霉素的生物合成:辛二糖C7′-N上甲基的甘氨酸来源

安普霉素是一类结构特殊的氨基糖苷类抗生素,其分子中含一个稀有的辛二糖结构单元.迄今为止,尚无关于安普霉素生物合成途径及其前体化合物的完整报道.研究发现,向发酵培养基中添加甘氨酸和丝氨酸均可以出现在菌体生长保持基本不变的情况下促进抗生素产量的现象,表明甘氨酸和/或丝氨酸可能参与了安普霉素的合成.[2-13C]甘氨酸示踪实验的核磁共振(NMR)检测结果表明,甘氨酸专一地掺入安普霉素辛二糖环C7′-N甲基.同时发现,菌体胞内的S腺苷甲硫氨酸(SAM)水平上升与外加甘氨酸的量呈正比,但是甲硫氨酸的加入会抑制安普霉素的合成.据报道,甲硫氨酸对结构中含有甲基取代基的抗生素,如对rapamycin的生物合成中转甲基过程有抑制作用.由此推测,尽管甲硫氨酸本身对抗生素产量呈抑制作用,甘氨酸仍然可能通过甲硫氨酸循环提供甲基.此外,[2-13C,15N]丝氨酸的示踪实验结果表明丝氨酸也可能作为安普霉素的限制性前体物参与了NH2的合成.     

单项氨基酸微量元素螯合物的研究

利用有机溶剂沉淀法制备了高纯度的甘氨酸铜、甘氨酸锌及赖氨酸锌螯合物 ,以螯合率为指标考察了合成工艺的主要影响因素 ,确定了最佳的原料配比 ,pH值及反应时间和温度。并通过化学分析、原子吸收分光光度分析和红外光谱分析对螯合物进行了研究 ,确证了螯合物的生成。     

用Bacillus subtilis NX-2菌株谷氨酰转肽酶催化合成S-苄基-谷胱甘肽

S-苄基-谷胱甘肽是合成谷胱甘肽的一种重要前体化合物。以L-谷氨酰胺为供体,S-苄基-半胱氨酰甘氨酸为受体．用Bacillus subtilis NX-2的γ-谷氨酰转肽酶催化进行转肽反应,合成得到S-苄基-谷胱甘肽。该化合物进行了质谱及核磁共振分析,并得到了初步鉴定。     

甾体激素对神经母细胞株SK-N-SH细胞摄取甘氨酸的快速作用

本研究观察了ＳＫ－Ｎ－ＳＨ细胞摄取甘氨酸的一般情况,并进一步研究了甾体激素对ＳＨ－Ｎ－ＳＨ细胞摄取甘氨酸的快速作用。结果显示：ＳＫ－Ｎ－ＳＨ细胞高亲和力的甘到摄取是Ｎａ＾＋和Ｃｌ＾－依赖性的。皮质酮、孕酮和地塞米松对这种摄取有快速促进作用,雌二醇和脱氧皮质酮无明显作用,表明甾体激素快速作用有特异性。皮质酮作用在１０＾－９￣１０＾－６ｍｏｌ／Ｌ范围内呈浓度依赖性。此质酮快速作用不受蛋白质合成抑制影响